Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

I pipetti capillari di vetro sono diventati onnipresenti nei laboratori per una vasta gamma di tecniche, come l'elettroporazione singola cellulare, la microiniezione di DNA e l'elettrofisiologia con tecnica del patch clamp. Per preparare gli elettrodi in vetro per il patch clamp per le registrazioni, il vetro silicatico viene tirato su un polarizzatore programmabile. Le punte degli elettrodi sono ricoperte di cera, quindi le punte vengono lucidate alla fiamma e conservate per un uso futuro. Ciao, sono Miriam Goodman del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford.

In questo video, mostrerò come realizzare pipette per patch clamp ed elettrodi affilati per l'elettrofisiologia. I microelettrodi di vetro, chiamati anche pipette, sono da decenni uno strumento fondamentale nell'elettrofisiologia. Oggi, queste pipette vengono prodotte a partire da capillari di vetro mediante un tiraggio programmabile.

Iniziamo. Per preparare le pipette per il patch clamp, utilizziamo capillari in vetro borosilicato Sutter privi di polvere e puliti, e impieghiamo il micropipettatore con filamento riscaldato Sutter P-97. Il Pipette Cookbook di Sutter è un'ottima risorsa di riferimento per sviluppare programmi di trazione adeguati.

Per iniziare, sollevare il coperchio antipolvere del puller. Prendere quindi un tubo capillare di vetro dalla scatola. Assicurarsi di richiudere il coperchio per ridurre al minimo l'accumulo di polvere.

Successivamente, con una mano, inserire il capillare nella scanalatura su un lato del filamento e stringere leggermente la pinza. A questo punto, la pinza deve essere abbastanza stretta da impedire al tubo di cadere, ma abbastanza allentata da consentirne lo scorrimento nella scanalatura. Ora, rilasciare il fermo in metallo a molla sullo stesso lato.

Quindi afferrare con il pollice e l'indice le linguette metalliche fissate alla base di entrambi i supporti. Rilasciare l'altro fermo in metallo a molla. Tirare i supporti insieme fino a quando possibile e mantenerli in posizione con una mano.

Successivamente, far scorrere la provetta attraverso il supporto del filamento fino alla scanalatura del portacampioni sull'altro lato. Evitare di spingere il vetro contro il filamento riscaldante. Stringere le fascette di serraggio su entrambi i lati.

Devono essere abbastanza stretti da mantenere i supporti in posizione, ma non così stretti da frantumare il vetro. Ora chiudere il coperchio antipolvere e premere il pulsante verde. Le pipette a punta per le registrazioni in patch clamp vengono formate utilizzando un programma di tiraggio in cinque fasi, con calore e velocità decrescenti a ogni fase e una piccola punta nell'ultima fase.

Questo programma utilizza calore e gravità. La procedura per la fabbricazione di elettrodi appuntiti è molto simile, ma in questo caso utilizziamo la capillare di vetro sottile di Warner Instruments che ha un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,78 millimetri. Applichiamo anche un programma di trazione che utilizza un motore in aggiunta al calore e alla gravità quando i programmi di trazione sono terminati.

Sollevare il coperchio antipolvere, allentare entrambe le pinze ed estrarre la pipetta finita. Successivamente, riporre le pipette in una scatola portaoggetti. La scatola può essere realizzata incollando una striscia di schiuma sul supporto di una scatola di punte di pipetta in plastica e praticando da sei a otto fessure nella schiuma.

Inserire le pipette nelle fessure. Una volta che la scatola è piena di pipette tirate, procedere alla fase di lucidatura a fiamma per lucidare le pipette. Impostare un apparato di microforgiatura con un filamento riscaldante al platino controllato da un pedale prima di iniziare la lucidatura a fiamma.

Applicare innanzitutto sulla pipetta uno strato di cera da odontotecnica per ridurre la capacità e migliorare le caratteristiche di rumore. A tale scopo, tenere a portata di mano una piccola quantità di cera fusa. Applicare una pressione d'aria sul retro della pipetta per impedire che la cera entri nella punta.

Quindi immergere brevemente la punta nella cera liquida. E rimuoverla ora. Posizionare la pipetta nell'apparato di lucidatura e avvicinare la punta a circa 50 micron dal filamento.

Tenere presente che il filamento si espanderà quando viene riscaldato. Applicare un breve impulso di calore di uno o due secondi per rimuovere la cera dalla punta della pipetta e levigare il vetro. Esaminare le punte delle pipette al microscopio per determinare il diametro dell'apertura e la levigatezza.

Per registrazioni standard con tecnica del patch clamp, le aperture delle punte devono avere un diametro compreso tra uno e tre micron; scartare le punte difettose, ruvide, irregolari o non uniformi. Posizionare la pipetta finita in una scatola per il lavoro, assicurandosi di chiudere il coperchio per proteggere le pipette dalla polvere; ripetere per 10 pipette di successo. Vi ho appena mostrato come realizzare pipette per patch clamp ed elettrodi affilati utilizzando un estrattore programmabile.

Lo stesso procedimento può essere utilizzato per realizzare una varietà di strumenti in vetro, inclusi aghi per iniezione ottimali per ottenere risultati di patch clamp di qualità. È fondamentale ricordare di tirare nuove pipette libere da polvere nello stesso giorno dell'esperimento e di lucidarle entro un'ora dall'esperimento. Inoltre, verificare con un'ispezione visiva che le pipette siano lisce e lucidate.

Assicurati di guardare il nostro altro video, che mostra come eseguire la registrazione con patch clamp di canali ionici espressi in oociti di opus. Bene, è tutto. Ora sei un esperto di pipette e buona fortuna con i tuoi esperimenti.