環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析

この手順は、まず水サンプルを5 µmおよび3 µmのフィルターで前ろ過して海洋微生物バイオマスを回収し、続いて0.22 µmフィルターで回収することから始まります。次に、0.22 µmフィルターに捕捉された生物から全RNAを抽出します。選択的な酵素分解および減法的ハイブリダイゼーションにより、全RNAからrRNAを除去し、濃縮したMr.NをpolyAテイル付加およびin vitro転写により線形増幅させます。

次に、増幅されたアンチセンスRNAをランダムヘキサマーを用いて二本鎖 cDNA に変換します。得られた cDNA は、クローニングしてシーケンシングするか、直接パイロシーケンシングすることが可能です。こんにちは、ジョージア大学海洋科学科の Marianne Moran 博士の研究室の Rachel Persky です。

本日は、環境サンプルからの遺伝子発現を解析する手順をご紹介します。環境メタトランスクリプトミクスを用いて、Scott Giffordが環境サンプルからRNAを回収するための処理方法を説明します。

サンプルからのRNA抽出およびJohanna RINsの方法について説明します。AONがRNA除去について実演し、その後、Maria KostaがRNA増幅とcDNA合成の手順を解説します。

それでは、始めていきましょう。環境RNAの採取を開始するために、まずフィルターラインシステムを設置します。チューブの一端をサンプリングに必要な深さの水中に配置し、もう一端を高容量の3 µmフィルターに接続し、その間にポンプを設置します。次に、3 µmフィルターを0.22 µmフィルタータワーに接続し、0.22 µmタワーからの流出液をメスシリンダーに導きます。

システムを洗浄するため、数リットルの水を流します。完了後、ポンプを作動させたままチューブを水から取り出し、ライン内に残った水を排出します。次に、ピンセットを使用して0.22 µmフィルターをフィルタータワーにセットし、蓋を閉めます。

チューブの端を再び水の中に戻し、ポンプを起動します。両方のフィルターから空気が完全に抜けるまで待ち、カーボーイでろ過された水の量をモニターします。目的の量までろ過されたら、チューブを水から取り出し、システム内に残っている水を排出します。

フィルターが乾き次第、速やかに上部フィルタープレートを取り外し、フィルターペーパーを折り畳みます。フィルターを whirl pack に入れ、液体窒素で急凍結させます。実験を開始する前に、RNAは遍在しており、またmRNAは速やかに分解されるため、作業台やピペットを含め、リボヌクレアーゼフリー環境で作業するための標準的な予防措置を遵守することが重要であることに注意してください。

これを踏まえ、本手順で使用するすべての材料を扱う際は、清潔な手袋を着用してください。また、サンプルは可能な限り短時間で処理する必要があります。0.22 µmフィルターから全RNAを抽出するための準備として、50 mLコニカルチューブにβ-メルカプトエタノールを添加したRLTバッファー 8 mLを加え、ビーズ破砕チューブを用意します。

次に、Mobile Power Soil Extraction KitのRNAビーズを1〜2 mL添加します。凍結したフィルターを速やかにフリーザーから取り出し、ワールドパックに入れたまま、マレットで砕いて粉砕します。

砕いたフィルターを準備した50 milliliterコニカルチューブに加え、チューブの蓋をパラフィルムまたはラボテープで密封し、10分間ボルテックスします。次に、50 milliliterチューブを5,000 RPMで1分間遠心分離します。室温で、可能な限り多くの溶出した液を取り出し、15 milliliterチューブに移した後、再び5分間遠心分離します。

5,000 ×gで遠心分離した後、上清を新しい50 mLチューブに移し、ライセートに1等量の100% ethanolを加えます。10 mLシリンジを用い、18〜21ゲージの針を通してライセートを吸引し、これを5回ほど繰り返します。その後の抽出ステップでは、メーカーの指示に従ってKaiGen R and easy mini kitを使用し、バキュームマニホールドまたは繰り返し遠心分離により、ライセートを付属のカラムに適用します。

分光光度計を用いて全RNAを定量します。全RNAの収量を決定した後、メーカーの指示に従ってAmbien turbo DNA free kitを使用し、DNA汚染を除去します。RNA抽出が完了したので、ここからは全RNAをJohannaに引き継ぎ、彼女が第1および第2のrRNA除去ステップを行います。

レイチェルさん、ありがとうございます。rRNA除去を開始するために、まず10倍反応バッファーを静かに混ぜ、短時間遠心分離します。滅菌済みのRNAフリー0.5 mLチューブに、10倍反応バッファー、RNAインヒビター、全RNAサンプル、およびターミネーターエキソヌクレアーゼを適切な量ずつ合わせます。Epicentre社のプロトコルに従い、加熱蓋付きのサーモサイクラーまたはウォーターバスを用いて、反応液を30 °Cで60分間インキュベートします。

次に、フェノール・エタノール沈殿法で反応を停止させます。まず、RNA-free waterを加えて全量を200 µLにし、続いてmRNA遠心分離用にフェノール・クロロホルム等量混合液を1容量加えます。水相を回収し、100%エタノールと塩で沈殿させます。ここで一旦中断することが可能です。

RNAは、ダウンストリームのアプリケーションで使用するまで-80°Cで保存できます。最初のmRNA濃縮が完了したら、メーカーの指示に従ってAmbien microbe enrichおよびmicrobe expressキットを使用し、サンプルから残留するrRNAを除去します。真核生物のrRNAを除去しやすくするため、microbe enrichキットを使用します。

すべての容量は、製造元の指示書に従って決定します。まず、1.5 milliliterチューブにbinding bufferを300 microliters分ピペットで分注します。そこに、最大30 microlitersの容量に溶解した5～100 microgramsの全RNAを加え、ボルテックスで混合します。

結合バッファーに、5 µgのRNAあたり2 µLのキャプチャーオリゴミックスを緩やかに加え、チューブを軽くタッピングします。混合液を短時間遠心します。混合液を70 °Cで10分間変性させた後、37 °Cで1時間アニールさせます。

このインキュベーションの間に、オリゴ磁性ビーズをヌクレアーゼフリー水で1回、次いで結合バッファーで1回洗浄し、洗浄の合間に磁気スタンドでビーズを回収して準備します。ビーズは氷上で保存し、室温まで温めておきます。使用の5分前に、ヒートブロックを用いて洗浄溶液を37°Cに加熱します。

洗浄済みのオリゴ磁性ビーズにRNAキャプチャーオリゴミックスを加え、チューブを穏やかに混ぜてスピンダウンさせます。この混合物を37°Cで15分間、短時間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに設置し、約3分間待機した後、mRNAを含む上清を吸引し、氷上の回収チューブに移します。

次に、あらかじめ温めておいた洗浄液100 µLを捕捉ビーズに加えます。捕捉ビーズを軽くボルテックスし、上清を回収します。mRNAを含むこの上清を、氷上の回収チューブに移します。

ambi microbe express kitを用いて原核生物由来のrRNAを除去する準備をしながら、回収チューブを氷上に置きます。このキットを使用して、残存する原核生物のrRNAを除去します。BioanalyzerまたはExperionを使用して、rRNAの混入とmRNAの品質を確認してください。ここで一旦停止することが可能です。

RNAは-80°Cで保存可能です。rRNAを除去した後、メーカーの指示に従ってAmbien message AMP two bacteria kitを使用し、mRNAを増幅させます。これで純粋なmRNAサンプルが得られましたので、ここからはMariaに交代し、mRNAの増幅とcDNA合成について解説してもらいます。

ハンナさん、ありがとうございます。mRNA増幅を開始する前に、Ambien message AMP two bacteria kitマスターミックスの各コンポーネントの量を算出してください。まず、最大1000 ngの全RNAを滅菌済みのRNAフリーマイクロ遠心チューブに入れ、テンプレートRNAのポリアデニル化を開始します。インビトロ転写によりRNAを合成するため、最初のバッファーに6.5 µLのサンプルを用い、RNAフリー水は使用しないでください。

温度が均一であるため、ハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーターの使用を推奨します。また、チューブ内部に結露が生じないことが極めて重要であるため、in vitro転写反応のインキュベーションは14時間行うことを強く推奨します。RNA収量を最大化し、最高水準のA RNA収量を得るには、最終反応容量 40 µL でIBTを実施してください。A RNAは、約 10 µL ずつに分注し、-80 °C で保存してください。

RNAの増幅が完了したら、相補的DNA（cDNA）を合成します。RNAからcDNAを合成するために、Promega社のUniversal riboClone cDNA synthesis system kitを使用します。このキットには、2 µgのRNAをcDNAに変換するための手順が記載されています。実際には6〜10 µgのRNAを入力し、それに合わせて反応系をスケールアップすることを推奨します。

エタノール沈殿法またはPromega Wizard DNA Cleanup Systemを用いて、cDNAを精製します。メーカーの指示に従い、サンプルを-80 °Cで保存してください。この時点で、二本鎖cDNAを直接シーケンシングすることが可能です。10 Lの海水から約10 µgの環境RNAを抽出し、20倍に増幅しました。増幅されたmRNAを二本鎖cDNAに変換することで、環境転写物のシーケンシングおよび解析に十分な量の材料を調製しました。以上で、環境メタトランスクリプトーム解析を用いて海洋微生物コミュニティの遺伝子発現を評価する方法について解説しました。

本手順を実施する際は、mRNAが速やかに分解されること、およびRNAが至る所に存在することを常に念頭に置いてください。したがって、RNaseフリー環境で作業するための標準的な予防措置を講じ、可能な限り迅速にサンプルを処理してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。