マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

こんにちは、エナです。私たちの研究室では、日常的に遺伝子発現プロファイリングを行っています。この手法を用いて、methと野生型の間で差次的に発現調節されている遺伝子をモニターしています。本日は野生型とmethのRNAサンプルを用意しており、まずcDNA合成を行います。

間接標識法を用いることで、直接標識で起こり得る観察者の主観によるバイアス（アイバイアス）を防ぐことができます。そのために、RNAサンプルを用意し、全量13 µLの中に3 µgのRNAを回収します。そして、ランダムヘキサマーを2.5 µg添加します。

サンプルを75℃で8分間インキュベートし、RNAを変性させます。次に、AM L-D-L-D-U-T-P 混合液、逆転写酵素バッファー、および逆転写酵素を含む逆転写カクテルを添加し、タッピングして混ぜ合わせます。その後、サンプルを42℃で4時間インキュベートします。4時間後、サンプルを取り出します。

現在、チューブ内にはcDNAとRNAの混合物があります。次に、水酸化ナトリウムとEDTAを添加してRNAをアルカリ加水分解します。水酸化ナトリウムの最終濃度は100 mM、EB緩衝液の最終濃度は5 mMとしてください。

次に、サンプルを65 °Cのウォーターバスで10分間インキュベートします。インキュベーションが完了しましたので、pH 7のHEPES緩衝液を最終濃度500 mMになるように添加し、サンプルを回収します。この時点でサンプルを-20 °Cで保存するか、そのままクリーンアップ工程に進むことができます。

cDNAの精製には、KaiGen PCR purification kitを使用します。ただし、Bush bufferおよびion bufferにはfreeingが含まれているため、自前でphosphate wash bufferとphosphate ion bufferを調製します。PPIを300 µL加え、それをゆっくりとピペッティングします。その後、混合液をカラムに移し、最高速度で1分間遠心分離します。次に、調製したphosphate wash bufferを750 µL加え、再度1分間遠心分離します。

念のため、もう一度遠心分離を行い、すべてのBedを回収します。その後、これらのチューブの内容物を空のエペンドルフチューブに移します。そして、pH 8.5の4 Mリン酸カリウムである、30 µLのphosphate E bufferを加えます。

ここで、すべてをカラムの中央に加えるように注意し、室温で1分間インキュベートします。再び1分間遠心分離を行い、さらに30 µLのzero bufferを加えて室温でインキュベートします。その後カラムを取り出すと、合計60 µLのCDAが得られます。

cDNAの精製後、-20°Cで保存するか、あるいは真空凍結乾燥させて保存することが可能です。したがって、ここではcDNAを真空凍結乾燥させています。現在、チューブ内には修飾された乾燥状態のcDNAが入っています。これから、この乾燥サンプルを再懸濁させます。

サンプルをpH 9の15 $\mu$L 重炭酸塩溶液に懸濁します。この工程では、ピペッティングを繰り返して行うだけで十分です。cDNAを十分に再懸濁させることが非常に重要です。結合反応を適切に機能させるため、蛍光ラベルは光に敏感であることから、この反応は暗室で行う必要があります。

しかし、これらはライフサイエンス社製を選択しており、個別のパッケージに入っています。S5は紫色のキャップ、S3はオレンジ色のキャップをしています。また、懸濁した際、S5はシアン色に、Caryはマゼンタ色に見えます。そのため、暗室において、これらのサンプルを染色チューブに移し、染料を再懸濁させてから、元のチューブに戻します。

その後、暗所で2時間インキュベートします。2時間のインキュベーション後、pH 5.2の100 mM酢酸ナトリウムを35 µL添加して反応を停止させます。その後、同様の精製手順でクリーンアップを行います。ただし、今回はQiagen社提供の洗浄バッファーおよび溶出バッファーを使用します。

サンプルの注入箇所について説明しますが、その前に器具の洗浄を行う必要があります。それでは、サンプルまたはブレンドを用意してください。こちらはscifiでラベル付けされたサンプルで、ここで確認できるOD 260はCDA含有量を、OD 650はscifiのD取り込み量を示しています。そして、こちらがside 3でラベル付けされたサンプルです。

再度、6つの濃度と5つの50測定部位に3回導入します。D社製装置が効率的に動作するため、ここでサンプルを混合し、短時間攪拌します。次に、フィードバックを用いて再度サンプルを記入します。

それでは、スライドの処理についてですが、まずスライドを水の上に浮かべて再水和させ、スポットを大きくします。その後、100 °Cで急速乾燥させて固定し、UVハイブリダイズまたはUVクロスリンクによってスポットをスライドに固定します。次に、用意したハイブリダイゼーション前バッファー中でインキュベートします。ここで、スライドを伏せて置きますが、まだ水には触れさせないようにします。

そのまま5分間待ちます。このように、ボックスがより大きく見え、投入前よりも光沢が増しているはずです。次に、スライドを100°Cで乾燥させ、結露がないか確認します。そして、youiを用いて架橋を行います。

次に、水和を行うため、スライドをあらかじめ温めておいた水に浸します。ここでは、スポットに結合していないすべてのオリゴヌクレオチドを除去することが目的であるため、この操作は迅速に行う必要があります。この工程に時間をかけすぎると、スポットに彗星のような裾を引く「コメットテール」が生じてしまいます。

迅速に行うよう注意し、スライドを水から上げないようにしてください。この操作を30秒間行い、すぐに室温で5分間、700 rpmで遠心分離します。次に、このスライドをあらかじめ用意したパイピングステーションバッファーに入れ、ゆっくりとスライドをジャーの中に押し込み、42 °Cで少なくとも45分間インキュベートします。ここでは、ハイブリダイゼーションを行うための乾燥試料があります。まず、これを水で再懸濁させます。

このステップでは、ピペッティングで懸濁させます。この際、サンプルを過度に曝露させないようにしてください。次に、10 mg/mL 濃度の精子DNAを 1.5 µL 添加します。そして、1.2 µM の tRNA を添加します。

濃度は12.5 mg/mLとし、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするためにtRNAと精子DNAを添加します。次に、最終濃度が3×となるように5.35 µLのMarker 03 10×SSCを添加します。最後に、1% SDSを3.5 µL添加します。

次に、混合物を5分間沸騰させ、最高速度で5分間遠心分離すれば、準備が整います。スライドのインキュベーションから1時間が経過し、現在は水とイソプロパノールを用意しています。まず、スライドを水で撹拌してSDSを除去し、次にイソプロパノールで洗浄した後、そのまま標準ゲージに入れます。

ここで、乾燥を防ぐために、ライトを空気にさらしすぎないよう注意してください。そのため、私はHarmStationバッファーから直接水へと移し、スライドを洗浄します。数分間洗浄しますが、動作は必ず上下方向のみとし、横方向には動かさないようにしてください。

また、スライドが液面から出ないように注意し、すぐにイソプロパノールに移します。そのまま数分間静置してください。その後、室温で5分間静置してください。

700 R.Cool. これでスライドのハイブリダイゼーション準備が整いました。埃から保護するため、スライドボックスに入れて保管することをお勧めします。ハーベストステーションでは、リフトまたはスリップを使用します。

カバーガラスには白いストリップが付いており、これによりカバーガラスとスライドの間にサンプルを挿入するためのわずかな隙間（リフト）が確保されます。これをエタノールで洗浄し、ゴミなどの粒子が付着していないことを確認します。まず、プリントエリアがマークされたテンプレートスライドを用意し、その上に準備したスライドを重ねて、完全に位置が合っていることを確認します。

完全に一致していることを確認してください。また、ストリップが側面にあること、そしてそれを下向きにする必要があることを確認してください。非常に見えにくいですが、視認できることを確認してください。

ストライプはスライドの両端にある必要があります。サンプルは両端からロードします。少量のサンプルを使用するため、まず 15 µL を取り、カバーガラスのコーナーからロードし始めます。

そして、ゆっくりと引き込みながら、端に沿って動かして全領域をカバーします。この段階では、気泡を混入させないことが非常に重要です。さらに別の15 µLのmigratorをスライドの側面に塗布し、乾燥を防ぎます。これでサンプルの準備が整いました。スライドをインキュベートしますが、ハイブリダイゼーション中にスライドを湿潤状態に保つためのマイクロチャネルを備えたprioritization chamberを使用します。

そして、3X SSCを10µLずつ、スライドの6か所に滴下します。チャンバー上の6か所、つまり各コーナーと各側面に滴下してください。カバーガラスがずれないよう、スライドを非常に慎重に移動させてください。スライドを正立させると、あらかじめ滴下した水に密着します。その後、カバーをかけ、ネジがしっかり締まっていることを確認してください。

コンバージョンチャンバーを65 °Cの水バッグ内でインキュベートしますが、底面に直接置くことは避けます。そのため、過剰な熱伝達を防ぐためにプラスチック製のバリアを設置します。そこにイオン化チャンバーをそっと配置し、位置がずれないように重りを置いても構いません。

このインキュベーションは一晩、通常10〜12時間行います。スライスの洗浄には、0.05% SDSを含む1X SSCを使用します。これはカバーガラスを取り除くための手順です。

これが最初の洗浄ステップになります。その後、SDSを除去するために、0.06% six XSCのみを用いてさらに2回のステップを行います。準備が整いましたら、スライドを取り出し、容器の中に裏返して入れます。

そのまま左右に振ると、カバーグラスが静かに外れます。次に、XESを含む別の洗浄バッファーに移し、1分間待ちます。

06 XSSCで洗浄します。FDSを完全に除去できているか確認するため、この操作をもう一度繰り返します。室温にて700 rpmで5分間遠心分離し、乾燥させます。このスライドは光感受性があるため、スライドボックスに入れて保管してください。

こちらはスライドスキャナーです。ここにある小さなスペースに、スライドを裏向きに、ラベルをこちらに向けてセットします。2枚目のスライドでは、スキャンしたい領域を指定します。私たちのスライドでは、この領域を選択します。スライドの作製には16ピンを使用しています。

したがって、各ブロックは1つのピンに対応しており、スライドには8,000以上のスポットが含まれています。また、遺伝子数が約4,000であるため、全ゲノムを2回表現しています。つまり、使用するオリゴあたり2つのスポットが存在することになります。

さらにズームして見ると、この特定の実験では、転写調節因子の変異体と野生型を比較していることがわかります。変異体には赤色を示すscifiでラベル付けされ、野生型には緑色を示すsite 3でラベル付けされています。したがって、これらのスポットのように赤く見える部分は、変異体における転写物の量が多く、野生型よりも高かったことを示しています。

したがって、それらは赤色または赤系の色で表示され、緑色に見えるものは、変異体と比較して野生型でその転写物の量が高かったことを示しています。また、黄色に見えるスポットは、その転写物が変異体と野生型の両方で同等に存在していたことを示しています。つまり、これらが重なり合うと、これらのスポットのように黄色く見えるということです。