ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

Joof幼虫の神経筋接合部から安定した電気生理学的記録を得るための手順です。まず、記録を行う前に幼虫を解剖して、体壁、筋肉、および神経系を露出させます。CNS基部の軸索は、腹側神経節の後方で切断します。

次に、記録電極を目的の筋肉に、刺激電極を神経支配を行う運動ニューロンの近傍に配置します。運動ニューロンの切断された軸索を刺激ピペット内に吸い込みます。これにより、興奮性接合後電位を記録することができます。

こんにちは。コロンビア大学生理学・細胞生物物理学部のMcCabe研究室のWendy MLAです。本日は、GE lavaの神経筋接合部におけるシナプス伝達を測定する手順をご紹介します。私たちは、シナプス生理学および神経伝達の研究にこの手順を研究室で利用しています。

それでは始めましょう。実験を開始するために、遊走期の3期および星状幼虫を解剖し、体壁を露出させます。このプロトコルは、短い解剖ピンを使用することで電気生理学的実験用に調整されています。

これらは長さが約2〜4mmであり、実験中に顕微鏡の対物レンズや電極に接触する可能性が低くなります。体壁を露出させた後、鉗子でCNSを保持してわずかに持ち上げます。次に、末梢神経の運動軸索を切断し、脳を除去します。

脳を取り出した後、解剖したサンプルを1 mMカルシウムを含むHL 3.1バッファーで2回洗浄します。解剖が完了したので、幼虫の筋細胞から細胞内記録を行うことができます。解剖プレートを電気生理学顕微鏡上に設置し、カルシウム添加HL 3.1バッファーでサンプルを浸します。

次に、バス電極を溶液に接触するように固定します。吸引電極は、筋肉を支配する末梢神経を刺激するために使用します。細胞内電極を筋肉に刺入する際の振動を防ぐため、先に吸引電極をディッシュ内に配置してください。

電極をディッシュに入れたら、筋肉6を支配する運動ニューロンの近くに配置します。第3腹節において、切断された神経がガラスピペットの中に入るまで、緩やかに吸引してください。吸引時に神経を伸ばさないよう注意してください。

ピペットをわずかに上げ、筋肉に触れないようにします。次に、切断された神経線維を引っ張らない位置に調整します。吸引電極を配置した後、細胞内記録用の記録電極を配置します。

3 M の塩化カリウムを満たした鋭利な微小電極を使用します。記録電極を筋肉6の中央の上に配置します。バス溶液に対してゼロになるように入力オフセットを調整します。

電極をゆっくりと下ろし、高倍率の光学顕微鏡で観察しながら、筋表面に接触するまで近づけます。筋に貫入したことを確認するため、オシロスコープを観察してください。静止膜電位が少なくとも-60 millivoltsである必要があります。

散発的なミニチュアnplate電位が確認できるはずです。記録電極を配置した後、細胞を1分間安定させます。記録を開始する前に、Axon HS-2（ヘッドステージ）およびAxon Clamp 2Bアンプを使用して、膜電位の変化を検出します。

axle clamp two Bは、信号をデジタル化するdigit data. 1322を介して、P clampソフトウェアを動作させるコンピュータに接続されています。膜電位をPCに記録します。clamp Xソフトウェアを用いて運動ニューロンの軸索に刺激を与え、興奮性膜電位またはEPSPを発生させます。

ejを生成した後、刺激同期なしで3分間にわたりミニejを記録します。トレースの解析およびmini EJPの振幅と頻度の決定には、Soft mini解析ソフトウェアを使用できます。ejを生成するには。

マスター8パルスジェネレーターを使用して、切断された運動ニューロン端を刺激します。ジェネレーターを用いて0.3 millisecondの方形電圧パルスを印加します。また、シナプス回復を促すため、刺激の間隔を5秒に設定します。

NMJにおいて、各筋肉から少なくとも10回の誘発電位を記録し、振幅の平均を算出します。この図は、野生型sal幼虫の第6筋肉から記録された、誘発EJP応答と自発的なmini EJPを伴う典型的なトレースを示しています。以上で、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部から電位を記録する方法を説明しました。この手順を行う際は、解剖を3分から10分以内に完了させ、細胞がまだ健全で反応が良い状態で直ちに電気生理学的記録を開始することが重要です。

解剖に時間がかかりすぎると、筋細胞の静止膜電位が-60 millivoltsを下回り、記録には低すぎることになります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。