シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

この手順は、まずショウジョウバエを育成することから始めます。all-transレチノールを含む餌を用いて、適切なジェノタイプを持つ3齢幼虫を育てます。各幼虫の頭部と尾部をピンで固定します。

次に、FLAを平らにします。その後、リズム的な運動活動を停止させるため、脳と後神経を切断します。続いて、コントロールボックス付きの青色LED光源を調整し、標本に焦点を合わせます。

最後に、鋭い電極を使用して筋肉6を刺します。次に、電圧源を用いて光パルスを照射します。こんにちは。ブランダイス大学生物学部のLeslie Griffith博士の研究室のNicholas Marsteinです。

こんにちは、GriffithラボのStefan Pulverです。本日は、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部において、channel root absent twoを用いてシナプス電位を誘発させる手順をご紹介します。当研究室では、ショウジョウバエのシナプス生理学を研究するためにこの手法を用いています。

また、これを学生へのシナプス生理学の指導や教育実習にも利用しています。それでは、始めていきましょう。このプロトコルの準備として、UAS channel redsin twoと3 7, 1 gal fourのショウジョウバエ系統を、標準的なショウジョウバエ培地を入れた個別のボトルで維持してください。

UAS channel redsinの2系統から、処女 flies および雄を、3 7、1 gal、four fly linesから採取します。次に、1 mMのall trans retinol（ATR）を混合したフライ培地を作製します。そのためには、通常のフライ培地を電子レンジで約1分間加熱して溶解させます。

培地を融解させた後、30〜60秒ほど冷却し、ショウジョウバエ培地10 mLあたり、100%エタノールに溶解した100 mMのa TRを100 µL添加します。a TR培地を入れたバイアルの準備が整ったら、収集したオスとメスをそれぞれのバイアルに入れます。バイアルを22〜25 °Cの暗所に置き、ハエに交配させ卵を産ませ、3齢幼虫が確認できるまで4〜5日間待ちます。

この時点で、成虫のハエを処分できます。これで、電気生理学装置のセットアップに進む準備が整いました。解剖顕微鏡の接眼レンズを、ヒートシンク付きの青色LED光源に取り付けます。

ポストとクランプを使用して、接眼レンズとLED光源にマグネットベースを取り付けます。マグネットベースを電気生理学装置のエアテーブル上に配置します。次に、光源を制御回路に接続し、その制御回路を外部電源に接続します。

AD Instruments社製のPowerLab電気生理学データ収集システムからの電圧出力を利用します。電圧源に接続したら、制御回路に1〜5 Vのパルスを与えて青色光を点灯させ、青色光のビームが幼虫の解剖部位に集中するように、マグネットベースと光源を調整します。適切に調整した後、幼虫の解剖に移行します。

解剖を始めるには、 agarをライニングしたディッシュの底に0.1 millimeterのピンを6本刺します。食餌培地からstar larvaeを3匹取り出し、プラスチック製のペトリ皿に移します。幼生に付着している餌を取り除くため、生理食塩水で幼生を洗浄します。

次に、幼虫を解剖皿のピンの近くに置き、皿の半分まで生理食塩水を満たします。ここで、動物の背面Cに沿って走る2本の銀色の管が見えるように幼虫の向きを調整してください。この銀色の管が気管です。

大きなピンを、気管の間から尾部に直接刺します。幼虫を固定し、2本目の大きなピンを頭部に刺します。この際、ピンを刺しながら体を縦方向に伸ばしてください。

ハサミを使用して、尾の近くに小さな切開を加えます。そのまま体の長さに沿って切開を続けます。この際、腹側神経や体壁筋を傷つけないよう、ハサミの先端を浮かせて切開してください。

動物の四隅に4本のピンを刺します。次に、中央部分を開きます。動物をフィレ状に広げるようにして、ピンを解剖皿に固定します。

また、ピンセットとハサミを用いて操作することを教えるため、標本を固定します。動物の消化管、気管、および脂肪体を摘出します。その後、標本を生理食塩水で洗浄します。

洗浄後、マイクロシザーを用いて、サンプルの前脳葉および腹側神経節を確認します。前脳葉の直後にある腹側神経節を慎重に切断します。解剖が完了したら、青色光刺激と筋肉記録に進みます。

筋記録を行うために、抵抗値が10から20 MΩの電極を引き出します。電子電極プラーを用いて、引き出した電極内に3 MのKClを満たします。充填した電極を電極ホルダーに装着します。

次に、リグ上の解剖顕微鏡下に幼虫の標本を配置します。青色光を調整し、解剖した標本が光線の中心にくるようにします。マイクロマニピュレーターを用いて、幼虫の体壁セグメントのいずれかにある第6筋（M6）を特定し、電極をM6に慎重に挿入して、筋肉の急速な過分極を確認します。

静止膜電位は-30 mVから-70 mVの範囲内である必要があります。電極が適切に挿入されたら、制御回路に20〜100 msの電圧パルスを与えます。制御回路に供給する電圧を段階的に増加させてください。

筋細胞における興奮性接合後電位を確認します。ここでは、短時間の光パルスによって誘発された興奮性接合後電位を示す代表的な結果を提示します。ここに示されている興奮性接合後電位の振幅は、共に活動していることが分かっている2つの運動ニューロンからの合計振幅です。

M 6。光の強度を低くするか、照射時間を短くすることで、単一の運動ニューロンからの振幅がより小さい興奮性接合後電位を抽出できます。ここでは、カエル（oph）の神経筋接合部において、チャネルロドプシン2を介したシナプス電位の刺激を行う方法を示しました。

この手順を行う際は、解剖中に標本の体壁を傷つけないように注意することが重要です。また、解剖直後は標本が過剰に興奮している場合がありますが、時間が経過するにつれて静まり、良好な記録が可能になることを覚えておいてください。筋肉に電極を刺入する際は、第一層の筋肉を超えて体壁まで達しないよう注意してください。

電極が体壁に刺さっている場合、超分極電位が観察されることがありますが、実際には筋細胞内にいない可能性があります。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。