抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

TEERアッセイの真にユニークな点は、抗原特異的T細胞を直接視覚化できることです。TEERこそが、本アッセイの最大の特徴であり、それに加えて増幅ステップを組み合わせています。

まずT細胞を分離し、目的のT細胞が濃縮される環境で培養します。これにより、特定の細胞のみを特異的に標識し、フローサイトメーターで可視化することが可能になります。CFSEなどの、数十年前から行われている増殖アッセイのような従来の解析では、T細胞集団全体の状況について、大まかなバルク測定の結果しか得られませんでした。

しかし、体内には数百万個のT細胞が存在し、それらは非常に多様なパターンのセットを認識しています。運が良ければ、サンプル中の20万から30万個に1個程度の細胞が、目的の細胞である可能性があります。だからこそ、このアッセイでは濃縮ステップを行う必要があるのです。

そして、テスト回数を重ね、直接染色を行うことで、全細胞数の1%未満という極めて低い集団であっても、バックグラウンドから切り離して視覚化することが可能です。そのため、非常にわずかな差を検出でき、その血液サンプル中、すなわち個体内に存在する、目的のパターンを認識するT細胞の数をかなり正確にカウントすることができます。さらに、テトラマーはこれらのT細胞をラベル付けするだけでなく、さらなる解析のためにそれらを単離することも可能にします。

そして、使用されているテターは実際にこちらのBRIで製造されたものということでしょうか？はい。私たちは、クラス2テターの製造に成功した国内でもごく少数の研究室の一つです。私たちの意向としては、この技術の導入に関心を持つあらゆる研究室に、これらの試薬を原価で提供することです。

このアッセイを他の研究室で再現する際に、最も困難または不可欠なポイントは何だと思われますか？そうですね、考えてみると主に2つの点があります。その一つがT細胞の培養です。これはある種の熟練した技術が必要な作業と言えます。

細胞にさらなる栄養が必要か、あるいは増殖させるための追加のスペースが必要かについて、ほぼ毎日判断を下す必要があります。そして、不慣れなオペレーターにとっておそらく最も困難だと思われるのが、実際のデータ解析です。信号のどの部分が真にポジティブな応答であり、どの部分が単に物理的な現象や誘引によるものなのかを見極める必要があります。

また、あらゆるものにある程度の吸着性があるという事実は、特に全体の反応が弱くなる状況において、習熟を要する点です。このアッセイで得られる情報が、現時点でどのように患者に利益をもたらす可能性があるのでしょうか。自己免疫疾患の患者にまず現れる特徴の一つに、その疾患に特異的な抗体群の集まりがあります。

免疫学の基礎から、抗体反応があるところには、常にその前にT細胞反応が存在することが分かっています。したがって、リスクのある個人のなかで、抗体形成に先行して起こるT細胞活性の上昇を確認できれば、自己抗体を保有することになる個人の新たなリスクレベルを定義する助けとなり、それが介入療法の機会を開くことにつながると期待されます。本手順では、抗原特異的なCD4陽性T細胞を精製および増幅し、teters試薬およびクラス2層流バイオセーフティキャビネットを用いてそれらを可視化します。

ここを手順の主要なワークスペースとします。PBMC分離用の主要チューブとして、50 milliliter コニカルチューブ、およびXPBSを準備します。XPBSはカルシウムおよびマグネシウムフリーである必要があります。遮光のため、フォイルパックをアルミホイルで巻いておきます。ピペットエイド、および遠心機内での血液汚染を防ぐための50 mil インサート付き CoStar 10 mil ピペットエアロゾルキャニスターを用意します。

GS 6 R遠心機、転送ピペット、パスツールピペット、溶血緩衝液（8.3 g/L 塩化アンモニウム、1.0 g/L 重炭酸ナトリウム、0.04 g/L DI sodium EDTAを含む）、PBS中0.2%トリパンブルー溶液、hemo CYTOMETER、15 mLコニカルチューブ、ランニングバッファー（2 mM EDTAおよび5 g/Lを添加したPBS）

BSA max CD four isolation kit twoはMilin biotechから購入し、EP magnet blockはstem cell technologiesから購入した。他の磁気細胞濃縮プラットフォームであっても、同等の有効性で利用可能である。5 mLポリプロピレンチューブ、25 mM HEPESを添加したRPMI 1640（T細胞培地調製に使用）、T細胞培地の添加剤として使用するプール済みヒト血清、T細胞培地の添加剤として使用するpen strip、500 mL 0.22 µm ボトルトップフィルター、in vitro増殖培養に使用する滅菌済み48ウェルプレート、37 °C CO2インキュベーター、目的のエピトープを含む20 mg/mLの合成ペプチド溶液。

抗原特異的T細胞を可視化するために、ペプチドをロードした5 mLポリスチレン製FAXチューブおよびクラス2のTEERを使用しました。抗原特異的T細胞のコーティングには、anti-CD3、anti-CD4、およびanti-CD25抗体を使用しました。手順を開始する前に、FAX Caliberフローサイトメーターまたは同等品を用意してください。すべての材料と装置を作業スペースに揃えます。

以下のデモンストレーションでは、次の手順について解説します。PBMCの単離、CD4陽性T細胞の分離、in vitroでの増殖培養、およびTEMまたは染色によるT細胞の可視化です。ステップ1：PBMCの単離。

血液サンプルを入手します。血液はシリンジまたは採血管で採取し、凝固を防ぐためにヘパリンを1:50の比率で添加して抗凝固処理を行います。血液1 mLあたり約100万個のPBMCが得られる見込みであり、その約40%がCD4陽性T細胞となります。

血液を50 mLコニカルチューブに分注します。1本あたり25 mLずつ分注してください。血漿を均一にするため、ALI凝固の前に血液を穏やかに混合します。

PBSを加えて全量を40 mLにし、血液チューブに挿入したバイアルの中の11 mLを乾燥させてアンダーレイ（下層形成）を行い、ピペットからピペットエイドを慎重に取り除きます。バイアルの中身はゆっくりとチューブの底へ流れ落ちます。液位が等しくなった後、血液チューブからゆっくりとピペットを抜き、血液チューブにキャップをして破棄し、エアゾルキャニスターへ移動させます。

キャニスターをしっかりと密閉し、ブレーキなしで 900 ×g で 20 分間遠心分離します。遠心終了時にブレーキをかけないことが極めて重要です。ブレーキによる衝撃で、遠心後の細胞層が乱れるためです。pbmc は、上層の黄色い血漿と下層の透明なフィコール層の間に、はっきりとした白色の層として形成されます。

トランスファーピペットを用いて、白血球層を慎重に吸い出し、新しいチューブに移します。PBMCとともに少量の血漿やフィブリンが吸引されることがありますが、赤血球層を吸い込まないようにしてください。通常、この段階で2本の血液チューブ分を1本の細胞チューブにまとめることができます。

ペレットのサイズを大きくするため、PBSを加えて全量を15 millilitersにし、低速ブレーキ設定で500 times Gにて15分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、ペーストピペットを用いて液を吸引します。各チューブに5から6 millilitersの溶血バッファーを加え、緩やかに混合して凝集塊を除去し、処理を行います。5分を超えない範囲でインキュベートします。

PBSを加えて全量を50 mLにし、230 ×gで10分間遠心分離します。このような低速回転では、低速ブレーキ設定のためエアロゾル防止用キャニスターは不要です。2回洗浄を行い、パスチャーピペットを用いて液を吸引した後、PBSを満たしたチューブに回収し、最終洗浄ステップの前に230 ×gで10分間遠心分離します。再懸濁した細胞の一部を分注して取り出し、トリパンブルーで希釈して血球計数器で計測します。

この細胞数に基づいて、T細胞分離に使用する試薬量を決定します。ステップ2のCD4陽性T細胞分離では、液を吸引し、1,000万細胞あたり合計40 µLになるようにランニングバッファーを加えます。通常、これにはバッファー30 µLと残存するペレット量が必要になります。

この液量を15 mLのコニカルチューブに移します。CD4分離キットの抗体カクテルを、細胞10 million個あたり10 µL添加し、チューブに蓋をして氷上で10分間静置します。チューブを氷上から取り出し、蓋を開けて、細胞10 million個あたり30 µLのランニングバッファーを添加します。

CD4分離キットの磁気ビーズを添加します。細胞1,000万個あたり20 µLをチューブに加え、氷上で15分間静置します。洗浄のために10倍量のランニングバッファーを加え、230 ×gで10分間遠心分離します。

遠心分離中に、ワークスペースにマグネットと5 mLポリプロピレンチューブを準備します。細胞ペレットから液を吸引します。2 mLのランニングバッファーを加え、転送ピペットを用いて凝集物を除去します。

同じ転送ピペットを使用して細胞を5 mLチューブに移し、マグネット内で15分間インキュベートする。マグネットを反転させ、最後の一滴を除いてすべて空にするようにして、CD4陽性T細胞画分を標識した15 mLチューブに注意深くデカントする。5 mLチューブにさらに2 mLのランニングバッファーを加え、マグネットから取り出す。

チューブの壁面に付着しているCD4陰性細胞を優しく洗い流し、ラベルを貼った15 mLチューブに移します。各チューブにT細胞培地を2 mL加えます。細胞計数用の分注液を採取し、230 ×gで10分間遠心分離します。

細胞のアリコートをトリパンブルーで希釈し、ヘモサイトメーターを用いて計測します。この細胞数に基づき、拡大培養に使用するウェル数を決定します。ステップ3へ進みます。

in vitro 拡大培養において、細胞数に基づき、CD4陽性およびCD4陰性の細胞ペレットから吸引液を除去します。CD4陽性細胞には培地を加え、細胞密度を3 million cells/mLに調整します。CD4陰性細胞には培地を加え、細胞密度を10 million cells/mLに調整します。

拡大培養には、1ウェルあたり300万個のCD4陰性細胞と200万〜300万個のCD4陽性細胞が必要です。通常、CD4陽性細胞が制限集団となります。CD4陰性細胞を48ウェルプレートの適切な数のウェルに分注します。

各ウェルに300 µLずつ添加し、プレートを37 °Cのインキュベーターで1時間静置します。プレートをインキュベーターから取り出し、500 µLの新鮮な培地を加えて、トランスファーピペットで12～20回緩やかにピペッティングし、液をすべて除去してウェルを洗浄します。この洗浄により、接着性の抗原提示細胞の層が残ります。

洗浄が完了したら、各ウェルの底を濡らすのに十分な量の培地（約100 µL）を加えます。そうしないと、接着細胞が乾燥してしまいます。必要に応じて、各ウェルに200万〜300万個のCD4陽性細胞を加えてください。

各ウェルの総容量が1 mLになるように、追加の培地を加えます。各ウェルに目的のペプチドを添加します。刺激に用いる標準的な濃度は10 µg/mLです。

最後に、プレートを37°Cのインキュベーターに7日間置いてください。7日後から、以降の日々、各ウェルに50 µLのhemo IL twoを添加します。

顕微鏡を用いて細胞の増殖をモニタリングします。まだコンフルエントになっていないウェルについては、培地の半分を除去し、新鮮な培地と50 µLのIL-2を添加します。コンフルエントになったウェルは、細胞を再懸濁し、細胞の半分を空のウェルに移動させることで分割します。その後、新鮮な培地と50 µLのIL-2を添加し、細胞をインキュベーターに戻します。増殖させた細胞は、培養13〜15日後にTEER染色の準備が整います。

ステップ4、テトラマー染色によるT細胞の可視化。CD4陽性T細胞を刺激するために使用したペプチド-MHC複合体に適合するテトラマーを購入または調製します。プレートをインキュベーターから取り出します。

各ウェルから培地の半分を慎重に吸引します。通常75 µL（約50,000個の細胞）の細胞分注量を、5 mLのポリスチレン製Falconチューブに各ウェルから移します。通常、総容量50 µLあたり1 µLのテトラマーを加え、37 °Cのインキュベーターで1時間置きます。また、陰性コントロールとして、各ウェルの2つ目の分注量をミスマッチテトラマーで染色することが推奨されます。細胞をanti-CD3、anti-CD4、およびanti-CD25抗体でラベルします。

追加または代替の抗体マーカーを使用することも可能です。ただし、このチャンネルは現時点でteems用に予約されているため、PE標識抗体は使用しないでください。また、シングルカラーコントロールまたはアイソタイプコントロールの標識には、別途追加の細胞を用いてください。

抗体標識した細胞を4°Cで15〜30分間インキュベートします。各チューブを0.5〜1 mLのランニングバッファーで洗浄し、230 ×gで10分間遠心分離します。 FACSチューブから上清を慎重にデカンテーションし、リファレンスビーズ、シングルカラーコントロールチューブ、アイソタイプコントロールなどを用いてフローサイトメーターのキャリブレーションを行います。

フローサイトメーターを用いて各チューブを解析します。テトラマー陽性細胞は、増殖させたCD4陽性T細胞の中で独立した集団として認められるはずです。テトラマー陽性細胞は通常CD25陽性であり、多くの場合CD4 highとなります。