同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で

ISTHとして知られる、in situ ハイブリダイゼーションとテトラマー染色の組み合わせ手法を用いることで、ウイルス抗原特異的な免疫エフェクター細胞と、ウイルスに感染した細胞および組織との相対的な数および空間的関係を決定することができます。ISTHは、まず新鮮なSIV感染組織をアガロースに包埋することから始まります。組織はビブラトームを用いて200 micronの厚さに切断され、ウイルス抗原の染色が行われます。

FITC標識MHCテトラマーを用いて、特定のCD8陽性細胞を染色します。凍結後、これらの染色切片をクライオスタットで8 µmの厚さにさらに切断し、in situ ハイブリダイゼーションを行うことでウイルス感染細胞を局在化させます。共焦点顕微鏡を用いて二重染色切片を画像化し、最終的に元の厚い切片を再構成することで、免疫エフェクター細胞と標的細胞との関係を明らかにします。

この手順を用いて初期のSIV感染を調べることで、その後の疾患の重症度を良好に予測できることが証明されました。こんにちは。私はミネソタ大学微生物学部のAshley HA研究室のChinen Leeです。私はミネソタ大学獣医生物医学部の助教授、Pam Skinnerです。

本日は、in situ tetramer染色とin situ hybridizationを組み合わせた手法、略してISTHの手順について解説します。本日実演するin situ tetramer染色とin situ hybridizationの組み合わせに加え、私たちは通常、in situ tetramer染色と免疫組織化学染色を組み合わせて、抗原特異的CD8+ T細胞のin situでの位置、数、およびタンパク質発現プロファイルを決定しています。本日の厚切り切片を用いたin situ tetramer染色の補助はHeon Kim博士とTerry Matala氏が、薄切り切片の作製とin situ hybridizationの補助はSo氏が担当します。それでは始めましょう。

本手順を開始するには、滅菌済みのPBSHを入れたVibramバスを2 °Cまで冷却します。バイブレーターブレードの角度を27度に設定してください。可能な限り、新鮮な組織は氷上で冷却して保管し、組織採取後24時間以内に手順を開始してください。

分解による冷却を最小限に抑えるため、新鮮な組織を切り出し、結合組織を取り除いた後、メスを用いて検体を細かく切り刻み、ウェーボートに入れ、40°C程度で融解させたPBS中の4%低融点アガロースで覆います。組織が容器の底に接していることを確認し、組織片が浮いている場合は押し下げ、氷上で3〜5分間凝固させます。

ここでは脾臓組織を使用していますが、メスを用いてリンパ節、膣、子宮頸部、子宮、またはその他の新鮮な組織を使用することも可能です。組織周囲のアグロスを切り取り、ピンセットを使ってアグロスに包まれた組織を組織ブロックに慎重に移します。続いて、Vibram組織ブロックにLoctite接着剤を塗布します。

組織片を組織ブロックにセットした後は、移動させないでください。氷上で約10分間乾燥させます。次に、組織ブロックを振動切片機に装着し、前進速度を極めて低速に、振幅を比較的高く設定して、組織を200 µm厚の切片に切断します。

ペイントブラシを用いて、切断した切片を、1 mLの冷却したPBSHで満たした24ウェル組織培養プレートのウェル内に設置された専用の組織チャンバーに移行させます。各組織チャンバーに最大4枚の組織切片を入れます。サンプルにラベルを貼り、ウイルス特異的T細胞の組織切片染色を行うため、ゴムバンドでプレートの蓋を固定します。

ZI結合テトラマーをまずブロッキングバッファーで0.5 micrograms per milliliterに希釈します。この溶液を24ウェルプレートに1ウェルあたり1 milliliterずつ分注します。切出したばかりの組織をプレートの組織チャンバーに移し、4 degrees Celsiusで一晩ロッキングします。

以降のステップにおいて溶液の相互汚染を防ぐため、異なるサンプルを含む組織チャンバーの間には空のウェルを1つ設けてください。このステップで、細胞外または細胞表面タンパク質に対する抗体を添加することができます。洗浄用に、一次インキュベーション後に使用する冷却したPBSHを入れた24ウェル組織培養プレートを準備してください。

組織チャンバーをあらかじめ溶液を満たしたプレートに移し、1回20分間、計2回洗浄します。この際、チャンバーを移す前に、チャンバー内の液体の大部分を必ず排出してください。また、組織チャンバーを移動させる際に、あるサンプルの内容物が別のサンプルに滴り落ちないように注意し、組織切片がチャンバーの側壁に貼り付いていないかを確認してください。固定後、PBSで調製した新鮮な4%パラアルデヒドを用いて、室温で2時間切片を固定します。

テトラマーからの信号を増幅させるため、冷PBSHで5分間ずつ2回洗浄します。切片をブロッキングバッファーで1:10,000に希釈したウサギ抗Fitzy抗体とともに1〜3日間インキュベートします。この段階で、細胞内エピトープに対する抗体を追加することができます。

抗体を添加する前に、細胞の透過処理を行い、非特異的サイトをブロッキングしてください。また、シグナルを増幅させるための2回目の長時間インキュベーション後に、抗原賦活化が必要になる場合があります。切片をPBSHで3回洗浄し、1回あたり少なくとも20分から数時間かけて洗ってください。

適切な蛍光標識抗体を用いて最終インキュベーションを行います。例えば、ウサギ抗Fitzy抗体に結合させてテトラマー染色細胞を赤色に蛍光させるために、goat anti rabbit SI threeを使用することがあります。キラーT細胞を可視化するためにCD eightなどの目的タンパク質をマウス抗体で対比染色した場合は、goat anti-US Alexa 488を使用してマウス抗体に結合させ、抗体染色細胞を緑色に蛍光させることができます。各抗体の希釈倍率は経験的に決定する必要があります。

1〜3日間インキュベートします。このインキュベーション中およびその後は、光によって蛍光が消光するため、プレートをアルミホイルで包んで遮光してください。最後に、テトラマーと抗体を固定するために、再び切片を固定します。洗浄後、4 mg/mLのN-プロピルガレートを含むグリセロールゼラチンを用いて顕微鏡スライドに封入し、in situ ハイブリダイゼーション用の薄切片を調製するまで-20 °Cで保存します。

in situテトラマー染色を施した切片を共焦点顕微鏡で解析し、抗原特異的CD8+ T細胞の局在、数、およびタンパク質発現パターンを決定します。表示されている画像は、SIV感染したレシピエントマカクの脾臓組織切片であり、SIV特異的CD8+ T細胞を標識するためにgagテトラマー、CD20抗体、およびCD3抗体で染色されています。抗体による対比染色は次のステップで消失するため、先に進む前にin situテトラマーの解析を行うことが重要です。

200 µm厚の切片をヒートブロックを用いて70 °Cで5分間加熱し、スライドガラスから剥離させてから、薄切の手順を開始します。切片が剥離したら、まずプラスチックモールドの底部にOCTを充填し、その上に組織を配置してさらにOCTで覆い、ドライアイス上でOCTに包埋します。

クライオスタットを用いて、OCT埋包切片から厚さ 8 µm の切片を作成し、シロナイズ処理したスライドガラスに貼り付けます。これらのスライドは、その後のin situハイブリダイゼーションに向けて、密封容器に入れて -80 °C で保存可能です。標準的なin situハイブリダイゼーションを用い、$^{35}$S 標識ウイルス特異的リボプローブによってウイルス感染細胞を検出します。

本手順には、切片への核トラックエマルションのコーティングおよびスライドの封入も含まれます。蛍光適合性のParamount媒質を用い、エピチューブブルー反射装置を備えたBioRad MRC 1000共焦点顕微鏡を使用して共焦点画像を撮像します。in situテトラマー染色は、赤色テトラマー蛍光色素にはEPI one 605を、in situハイブリダイゼーション用の緑色CD8蛍光色素にはEPI 2 522 DF 32を用いて可視化します。

現像されたラジオオートグラフにおいて、in-situ hybridizationシグナルに由来する銀粒子を観察するには、EPI two blue reflectionを使用してください。画像取得を開始する際は、各セクションの画像を左から右へ、上から下へと取得し、隣接する画像と約20%重なるように撮影してください。再構成したモンタージュ画像に隙間が生じないよう、Excelファイルにて各画像に行と列に基づいた名前を付けて管理してください。

スライドからのデータ収集が完了したら、著者から提供されるPhotoshop 7のアクションプロシージャを用いて、共焦点アシスタントソフトウェアで各チャネルのZ系列画像を単一の画像に投影し、3つのチャネルから投影された画像を1つのRGB画像に自動的に統合します。次に、統合された画像をレイヤーで繋ぎ合わせ、切片全体のモンタージュ画像を作成します。MetamorphまたはPhotoshopを使用して、モンタージュ内の個々の銀粒子およびテトラマー染色を細胞に関連付けます。

ウイルスRNA陽性細胞およびテトラマー陽性細胞の中心のXY座標またはOIDを割り当てます。OIDデータを数値としてExcelファイルにエクスポートし、Excelファイルに収集されたデータを用いて、切片内のテトラマー陽性細胞とウイルスRNA陽性細胞の総数から、免疫エフェクター細胞（E細胞）とウイルス標的細胞（T細胞）の比率を算出し、テトラマー陽性細胞とRNA陽性細胞の間の空間的関係を把握します。Excelファイルからそれぞれのプロットをコピーし、Photoshopのドキュメントに貼り付けます。

レイヤーの不透明度を下げてグリッドを調整およびスケールさせ、色と選択範囲を一致させた後、新しいレイヤーにコピー＆ペーストします。青色のRNA陽性細胞の位置を確認し、グリッドの調整に使用したレイヤーを削除すると、統合された画像にテトラマー陽性細胞およびウイルスRNA陽性細胞の位置が表示されます。ここで示したISTH法を用いることで、腟内接種による侵入経路および感染が広がるリンパ組織におけるSIV感染に対する免疫応答を追跡することが可能です。

感染後10日目には、これらの組織部位に多数の感染細胞が存在していますが、その3日後になっても、緑色に染色されたCD8陽性細胞は見られるものの、赤色に染色されたSIV特異的テトラマー陽性細胞はまだ現れていません。したがって、免疫応答は感染を排除するには遅すぎることになります。

しかし、感染から3週間後には、特に侵入部位において、感染細胞の減少が明確に観察されます。我々はISTHを用いて、この減少の程度が、テトラマー陽性の免疫エフェクター細胞との空間的近接性および相対的な数と相関していることを示しました。N-S-I-V-R-N-A陽性の標的細胞に対する比率であり、これをin vivo E:T比と呼びます。

この方法を用いることで、感染したリンパ節におけるエフェクター細胞を赤色、ウイルス標的細胞を青色として、空間的な関係を容易に可視化できます。多くのエフェクター細胞と標的細胞が近接しており、多数のエフェクター細胞が単一のS-I-V-R-N-A陽性細胞を取り囲んでいる領域がある一方で、S-I-V-R-N-A陽性細胞が単独で存在する領域もあります。細胞の位置を特定し、Excelファイルにそれぞれの数を記録することで、E:T比は単純に算出されます。

ウイルス感染の最も良好な制御は、赤色で示されるエフェクター細胞が緑色の標的細胞に対して43対1という大幅な超過状態にあることと相関しています。本ケースでは、感染が開始した子宮頸部および腟において、リンパ節よりもE:T比が低くなっていました。高いE:T比とピーク時からのウイルス量の減少との間に正の相関があることは、侵入口におけるより強固な免疫応答が、より良好な感染制御につながることを示しています。

以上で、非常に特異的なCD8+ T細胞とウイルス感染細胞をin situで同時に検出する方法について説明しました。この手法を用いることで、組織内における抗原特異的T細胞とウイルス感染細胞を同時に可視化することが可能になります。本手法は、CD8陽性T細胞ベースのワクチンの評価や、ワクチン以外の病原体と宿主の相互作用の解析に応用することができます。

in situ ハイブリダイゼーションを行う前に、すべての試薬をRNaseフリーに保つことが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。