S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

この手順は、SLACコントロール株では通常のアミノ酸を含む培地で、ベイト株では重同位体標識リシンおよびアルギニンを含む培地で培養することから始まります。両方の株を等量混合し、研磨および液体窒素を用いて溶解させます。粗抽出液をまず遠心分離でペレット化し、次いでspherosビーズに結合させて精製します。その後、細胞溶解液をIgGビーズに結合させます。

IgGビーズに結合したタンパク質をプロテアーゼで切断し、沈殿させます。これで、サンプルを質量分析に供する準備が整いました。こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学生命科学研究所の細胞環境生物学部門にあるLone LabのJesse Chaoです。

本日は、アフィニティー精製と組み合わせたSILACと呼ばれる定量プロテオミクス解析の手法をご紹介します。当研究室では、タンパク質複合体の研究にこの手法を用いています。

それでは始めていきましょう。この手順では、ベイト株には通常のアミノ酸が含まれており、SLACコントロール株には重同位体標識されたリシンとアルギニンが含まれています。まず、ベイト株とコントロール株をそれぞれ1リットルずつ、画面に表示されている値まで個別に培養します。次に、培養液を500 mLのNalgene遠心チューブに分注してください。

2,580 RCFでペレット細胞の負荷を調整し、培地をデカントしてペレットを再懸濁します。冷PBS 50 mLを用いて細胞を50 mL遠心チューブに移し、3,000 RCFで遠心して細胞をペレット化します。この時点で、ペレットを-80°Cで凍結保存することが可能です。

対照菌株の培養物とベイト菌株の培養物を、乾燥ペレット重量に基づき1:1の割合で合わせることが重要です。各細胞ペレットを、1:2000のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む10 millilitersのNP 40緩衝液で再懸濁します。一方のチューブの内容物をもう一方へ直接移すことで、2つの細胞培養物を混合します。

細胞の研磨を開始するために、まず、あらかじめ冷却した乳鉢に液体窒素を注ぎ、完全に蒸発させます。次に、2 mLの細胞懸濁液を乳鉢に加えます。さらに液体窒素を注ぎ、細胞を凍結させます。

細胞が微粉末になるまで研磨します。すべての細胞が研磨されるまでこの工程を繰り返してください。その際、細胞を融解させないように注意してください。

必要に応じて液体窒素を追加します。次に、粉末を氷冷したビーカーに移し、室温で解凍します。端が溶け始めたら、解凍後、1:200に希釈したPICを含むNP 40バッファーを20 milliliters加えます。

粗溶解物を40 mLのNalgeneチューブに移し、Sovos SA 600ローターを用いて16,000 RPMで30分間遠心分離します。待機している間に、300 µLのSROs two Bビーズを分取し、300 µLのNP 40バッファーで3回洗浄します。次に、ビーズを300 µLのバッファーに再懸濁し、1:1のスラリー状にします。

次のステップは、細胞溶解物をプレクリアすることです。まず、上清を新しいチューブに移し、Spheros 2B ビーズを加えます。低温室の回転台上にて30分間インキュベートしてください。

インキュベーションの間、300 µLのIgG SROs six beadsを採取し、300 µLのNP 40バッファーで3回洗浄します。その後、ビーズを300 µLのバッファーに再懸濁し、1:1の懸濁液（スラリー）にします。インキュベーション後、SROsをペレット化します。

ビーズを2回投入します。上清を新しいチューブに回収します。後でウェスタンブロッティングに使用するため、細胞ライセートの一部を分注して保存しておくことを忘れないでください。

次に、IgGビーズを添加します。より効率的に結合させるため、内容物を2本のチューブに分け、コールドルーム内の回転台上にて2時間インキュベートします。インキュベート後、4 °Cでクロマトグラフィーカラムを用いてビーズを回収します。

未結合画分の分注量を必ず保存しておいてください。ビーズを10 millilitersのNP 40バッファーで洗浄します。

次に、ビーズを3 mLのTEVCバッファーで洗浄します。ここでも、ビーズの一部を分注して保存しておくことを忘れないでください。

これにより、ビーズを溶出させるための結合効率が反映されます。まず、1 mLのTEVCバッファーに5 µLのA-C-T-E-Vを加えます。ビーズにTEVCバッファーを加え、混合します。

より効率的に混合するため、内容物を2本の1.5 milliliter EINORチューブに移し、低温室の回転プラットフォームで一晩インキュベートします。次に、ビーズを遠心して沈殿させ、溶出液を新しい1.5 milliliterチューブに移します。洗浄後、さらに0.5 millilitersのTEVCバッファーでビーズを洗浄します。

8本分を1本のチューブにまとめます。合計で1.5 millilitersのELU eightが得られるはずです。沈殿させるために、TEV Elu eightのアリコートを保存しておきます。

100% TCAを用いて、分注試料のTCA濃度を25%に調整します。具体的には、1.5 mLのLU 8を2本のチューブに750 µLずつ分注します。その後、各チューブに250 µLの100% TCAを加えます。

溶液が乳白色に変わります。次に、氷上に30分間静置します。インキュベーション後、定期的に混合物をボルテックスしてください。

コールドルーム内の卓上遠心機を用いて、最大速度で30分間遠心分離します。0.05 N 塩酸を含む氷冷アセトン 500 µL で1回洗浄します。その後、4 °C で最大速度にて5分間遠心分離します。

次に、500 µLの氷冷アセトンで1回洗浄し、4 °Cで最大速度で5分間遠心分離します。遠心分離後、アセトンを慎重に取り除き、銀染色用にペレットを乾燥させます。その後、ペレットを50 µLの1×SDSサンプルバッファーで再懸濁します。

沈殿させたタンパク質を質量分析ベースの解析に使用する場合は、エタノールを用いて沈殿させることを推奨します。まず、20 µgのグリコーゲンを添加し、次にサンプルを100%エタノールで5倍に希釈して、pH 5.0の2.5 Mストック溶液を用いて50 mM重炭酸ナトリウムに調整します。チューブを反転させて溶液を混合してください。

室温で2時間静置します。最後に、内容物を2本のエッペンドルフチューブに分けます。室温にて12,000 GSで10分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化します。

精製手順中に保存した分注試料には、プレクリア済みの細胞溶解液、結合画分、非結合画分、および溶出画分を含める必要があります。実験の結合および溶出効率を反映させるため、上記の分注試料のタンパク質含有量を、Anti-TAP抗体を用いたウェスタンブロッティングまたは銀染色によって分析することを推奨します。この銀染色ゲルでは、精製されたSCS two tapとその相互作用パートナーが可視化され、このウェスタンブロットにおけるタグなしコントロールと比較されました。

SCS two tapの精製過程で回収した各画分を、Anti-tap抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析しました。TEVプロテアーゼによる切断後の溶出において、SCS two tapがより低い分子量に移動していること、および溶出後のIgGビーズ上にSCS two tapが残っていないことが確認されました。これにより、本精製法が極めて効率的であることが裏付けられました。

IgGビーズを用いたアフィニティー精製により、タンパク質複合体を精製する方法について説明しました。この手順を行う際は、精製操作を開始する前に、ベース菌株とコントロール菌株の乾燥重量を必ず合わせておくことが重要です。LACではタンパク質結合パートナーの偏りのない定量的な測定が可能であるため、サンプルの損失を最小限に抑えるために、TAP精製の第一段階のみを実施します。

非特異的結合が著しい場合は、Cold Spring Harborのマニュアルに記載されている全プロトコルを実施することをご検討ください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

ねえ、いい加減にして、マーク。あぁ、行って。