ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

この実験戦略の全体的な目標は、青色のネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティー精製タンパク質複合体の分画、および質量分析相関プロファイリングを通じて、タンパク質が関与する可能性のある異なる機能集合体を分離することです。この方法は、アフィニティー精製の大規模分光実験によって生成されたタンパク質リストに組織情報を追加するのに役立ちます。この手順の主な利点は、実行が簡単で、分解能が良好で、従来のゲルCMSMSよりも手間がかからないことです。

このプロトコールは、FLAGタグ付きタンパク質の内因性レベルを発現する2億から5億個の細胞のタンパク質複合体の精製に最適化されています。細胞ペレットを解凍した後、テキストプロトコルに記載されているように、DTTおよびプロテアーゼ阻害剤を含む5ミリリットルの氷冷溶解緩衝液を細胞懸濁液に加え、渦巻き状にして混合します。懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。

細胞懸濁液をコールドダウンホモジナイザーに移します。目立つ粘度がなくなるまでタイトな乳棒を使用して、20〜30回のストロークで細胞を溶解し、ホモジネートを冷たいマイクロ遠心チューブに移します。チューブを遠心分離した後、透明化したライセートを清潔なコールドチューブに移し、約50マイクロリットルのライセートを残します。

35マイクロリットルのライセート分を保存して、タンパク質濃度を測定し、精製をモニターします。次に、前に調製したビーズからバッファーを取り出します。ビーズを1ミリリットルのライセートで再懸濁し、残りのライセートと混合します。

混合物を摂氏4度の回転ホイール上で1〜2時間インキュベートします。チューブの側面にあるビーズを磁石で集めます。30マイクロリットルのアリコートの上清を収集し、残りを捨てます。

0.5ミリリットルのIPP150バッファーに4〜6回ピペッティングしてビーズを再懸濁します。次に、懸濁液を1.5ミリリットルのコールドチューブに移します。次に、0.5ミリリットルのFLAG溶出ネイティブバッファーでビーズを3回洗浄します。

最後の洗浄で、ビーズを新しいコールドチューブに移します。バッファを完全に取り外します。100マイクロリットルの200マイクログラム/ミリリットルの3X5ペプチドにビーズを再懸濁します。

その後、4°Cで10分間、穏やかに回転させてインキュベートします。ビーズを磁石で集め、上清を冷たい新しいチューブに移します。この手順を 2 回繰り返してから、すべての溶出液を取り出します。

溶出液を遠心フィルターユニット内で25マイクロリットルまで濃縮し、摂氏4度でGの10,000倍を遠心分離します。25 μL の濃縮溶出液に 4X ネイティブサンプルローディングバッファーと 0.5%G-250 サンプル添加剤を加えて、サンプルを調製します。サンプルと天然分子量マーカーをロードし、それらの間に空のウェルを残します。

次に、10〜20マイクロリットルの1Xネイティブサンプルローディングバッファーをすべての空のウェルにロードします。カソードチャンバーに200ミリリットルの1X native PAGEダークブルーカソードバッファーを慎重に充填し、サンプルを乱さないようにします。アノードチャンバーに550ミリリットルの1X PAGEネイティブアノードバッファーを充填します。

ゲルを150ボルトで30分間泳がせます。ランを停止した後、セロジカルピペットでダークブルーカソードバッファーを取り外し、1Xライトブルーカソードバッファーと交換します。60分間泳動を続けた後、ゲルカセットを開けてカセットプレートの1枚を捨てます。

ゲルは他のカセットプレートに付着したままです。ゲルを覆うのに十分な固定液が入ったトレイにゲルを置き、穏やかに振とうしながら30分間インキュベートします。次に、固定液を取り出し、水で置き換えてからゲルをスキャンします。

質量分析の準備をするには、まず円錐形の底部96ウェルプレートを別の96ウェルプレートの上に置いて、廃棄物を回収します。円錐形の底部96ウェルプレートのウェルの底に21ゲージの針で穴を開けます。次に、200マイクロリットルの50%アセトニトリル、0.25%ギ酸をピアスプレートのウェルに加えます。

プレートスタックをシェーカーで10分間インキュベートします。次に、プレートをGの500倍で1分間遠心分離し、液体が穴を通って廃棄物収集プレートに流れ込むようにします。洗浄手順を2回繰り返した後、ピアスを開けた96ウェルプレートのウェルに150マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウムを満たします。

次に、ゲルをきれいな面に置きます。サンプルを含むレーンを 48 個の同一のスライスにスライスします。各スライスを2つまたは3つの小さな部分にカットしますが、ゲルの上部にある最後の5つのスライスを除いて。

各スライスを、ピアス端洗浄96ウェルプレートの1つのウェルに順次配置する。各ウェルに50マイクロリットルのアセトニトリルを加え、プレートを30〜60分間振とうしながらインキュベートします。遠心分離により液体を除去した後、各ウェルに200マイクロリットルの2mmTSEBと50ミリモルの重炭酸アンモニウムを加えます。

プレートを室温で30分間振とうしながらインキュベートした後、前回と同様に遠心分離により液体を除去します。200マイクロリットルの純粋なアセトニトリルを加えてゲル片を脱水し、ゲル片が白く不透明になるまで室温で20分間振とうしながらインキュベートします。アセトニトリルを除去した後、各ウェルに冷たい重炭酸アンモニウムに150マイクロリットルのトリプシンを加えます。

プレートを摂氏37度で2時間振とうしながらインキュベートします。次に、ゲル含有プレートの下にきれいな円錐形の底プレートを置き、プレートの正しい向きを確保します。次に、ペプチドを含む液体をGの200倍で1分間遠心分離して回収します。

ペプチド含有プレートを遠心式蒸発器に入れ、次のステップを実行しながら液体を蒸発させます。150マイクロリットルの50%アセトニトリル、0.25%ギ酸をゲル片に加えます。37°Cで30分間振とうしながらインキュベートします。

部分的に乾燥させたプレートに液体を200倍Gで1分間遠心分離して集めます。次のステップを実行しながら、ペプチド含有プレートの蒸発を続けます。ペプチド溶液を洗浄した遠心ろ過プレートに移します。

その下にきれいな円錐形の底板を置き、ペプチドを収集し、以前と同様にプレートスタックを遠心分離します。ウェルが完全に乾くまで、円錐形の底板で液体を蒸発させます。乾燥したら、プレートをシリコン製の蓋で覆い、テキストプロトコルに記載されている質量分析とデータ分析を行うまで、摂氏マイナス20度で保存できます。

ここでは、Mta2 の青色ネイティブ PAGE 移動プロファイルと共精製タンパク質の階層クラスタリングの代表的な結果を、樹状図とタンパク質強度を表すヒートマップとして示しています。Mta2の移行プロファイルは、2つの異なる複合体を示す2つのピークを示しています。一部のNuRDサブユニットは、低分子量アセンブリで存在量が最も多い同様のパターンを示します。

対照的に、他のNuRDサブユニットは、高分子量のNuRDアセンブリに多く含まれています。一方、Mta2インタラクターであるCdk2ap1は、高分子量のNuRDアセンブリにのみ存在します。一度習得すれば、このテクニックは2日半で完了します。

この手順を試みる際には、タンパク質複合体の解離を避けるために、すべてのサンプルと試薬を氷上に保管することを覚えておくことが重要です。この手順は、天然条件での競合溶出によってアフィニティー培地から観察できる場合に限り、関心のある任意のタンパク質に適用できます。この手順に続いて、リバースまたはシーケンシャル共免疫沈降などの他の方法を実行して、同定されたサブコンプレックスをバリデーションすることができます。