gentleMACS Dissociatorを使用してマウスの肺組織からの単細胞懸濁液の標準化の準備
2009年7月2日
特定の組織型から解離し細胞は組織の攪拌のための特定のパラメータは、実行可能な、培養可能な細胞の大量を取得する必要があります。ミルテニーgentleMACS dissociatorは、シンプルで実用的なプロトコルを使用してこのタスクを最適化します。本書では肺組織でこの装置の使用は説明されています。
このビデオプロトコルでは、肺組織の解離後、GentleMACSを用いて成マウスの肺組織を解離する方法を説明します。コラゲナーゼDおよびDNase Iの存在下で、単一細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過し、遠心分離を行い、その後のアプリケーションのために懸濁させます。こんにちは。ドイツのMiltenyi Biotec社のMelanie Mluです。
本日は、GenX dissociationを用いてマウス肺組織から単一細胞懸濁液を調製するための、再現性のある自動化された手順について解説します。当研究室では、白血球や内皮細胞を調製するための単一細胞懸濁液の作製にこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。
プロトコルを開始する前に、いくつかの標準溶液を調製し、準備しておく必要があります。まず、HEPES緩衝液が必要です。次に、100 mg/mLの酵素を含むコラゲナーゼD溶液とHEPES緩衝液を準備します。
3つ目は、1mLあたり20,000ユニットのDase Oneを含むDase One溶液です。最後に、2種類の一般的な緩衝液を用意します。pH 7.2の標準的なPBS緩衝液と、AutoMax洗浄液およびBSAストック溶液から調製したPEB緩衝液です。
まず、生後6〜7週の雌のバイオプシーマウスから摘出した肺を用いてプロトコルを開始します。肺に、心臓や胸腺などの隣接器官、出入口の血管、気管、および結合組織が付着していないことを確認してください。赤血球を除去するため、PBSを入れたペトリ皿の中で組織を洗浄します。
通常、この月齢のマウスの肺の重量は110から150 mgの間です。より高齢の動物や他のマウス系統の肺を分離させる場合は、組織とバッファーの重量を測定してください。1本のチューブにつき、最大450 mgの組織まで分離可能です。
肺組織を4.9 millilitersのHEIS緩衝液が入ったGentleMax Cチューブに移します。肺組織と緩衝液に、最終濃度が2 mg/mLとなるように100 µLのコラゲナーゼD溶液を加えます。次に、10 µLのDNAaseを加えます。
150 mg以上の組織に対して1セットの溶液を使用します。溶液1を20 µL加えます。Cチューブがしっかりと閉じていることを確認し、GentleMax Disの上に逆さまに配置します。
組織がローターとステーターの間に位置していることを確認します。肺（lung）プログラムを選択し、スタートボタンを押して実行します。プログラム終了後、器具からCチューブを取り出し、サンプルを30分間インキュベートします。
37 °Cのインキュベーターでのインキュベーション中、チューブはMax Mixチューブローテーターを用いて回転させるか、5分ごとに手動で回転させてください。インキュベーション後、CチューブをGentleMax dissociatorに戻し、2番目の肺用プログラムを実行します。プログラムの実行中に、キャップを70 µmメッシュのセルストレーナーに交換した50 mLチューブを用意し、ろ過後の細胞を回収できるようにしておきます。解離プログラムが終了後、チューブ内のサンプル材料の分布に応じて、サンプル材料を濃縮するためにチューブを短時間遠心分離してください。
解離した細胞は、Cチューブのセプタム封止キャップを通してピペッティングすることで回収できます。適切な1000 µLピペットチップを使用して、細胞懸濁液をセルストレーナーに適用し、大きな粒子や凝集物を除去します。溶液がすべて流れ落ちたら、室温のHBSSバッファーをさらに5 mL加えてセルストレーナーを洗浄し、ろ過された細胞をペレット化します。
50 mLチューブを300 gで10分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、細胞ペレットを室温のPEBバッファーの任意の容量で再懸濁します。
上清をデカントしないでください。これで、後続のアプリケーションに進むことができます。この手順を用いてマウス肺組織を解離させると、高比率の生存白血球および内皮細胞が得られます。
得られた単一細胞懸濁液をCD 45 PE、CD 1 46 FITC、またはCD 31 FITCで染色し、フローサイトメトリーで解析しました。このプロットは、CD 11 Cマイクロビーズ、ミニマックスセパレーター、および2本のMSカラムを用いた樹状細胞の濃縮を示しています。これで、GentleMix解離装置とCチューブを用いて、マウス肺組織から標準的な方法で単一細胞懸濁液を調製する方法を説明しました。
本手法により、効率的な組織解離が可能です。この手順を行う際は、肺を適切に摘出し、摘出後すぐに組織を処理することが重要です。こうして調製した単一細胞懸濁液は、その後のさらなる実験に使用できます。
例えば、細胞の磁気標識を行い、その後白血球または内皮細胞を分離します。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。
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概要
このビデオプロトコルでは、gentleMACS dissociatorを用いて成体マウスの肺組織を解離する方法を解説します。この手順は、その後のアプリケーションに向けて、生存率が高く培養可能な細胞を大量に調製することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞解離技術
- 単一細胞懸濁液の調製
- マウス肺組織解析
背景
- 組織から細胞を分離するには、特定のパラメータが必要です。
- gentleMACS dissociatorは、最適化されたプロトコルを提供します。
- 分離プロセスでは、Collagenase DおよびDNaseが使用されます。
- その後のアプリケーションに向けて、ろ過した細胞懸濁液を調製します。
研究の目的
- 単一細胞懸濁液を調製するための再現可能な方法を実証すること。
- 白血球および内皮細胞の研究を促進すること。
- 当該分野の研究者に実用的なプロトコルを提供すること。
使用方法
- 組織の攪拌にgentleMACS dissociatorを使用する。
- 解離中にコラゲナーゼDおよびDNaseを添加する。
- 70 micronのセルストレーナーを用いて細胞懸濁液をろ過する。
- 遠心分離を行い、以降の工程のために細胞を懸濁させる。
主な結果
- マウス肺組織から単一細胞懸濁液への解離に成功した。
- 生存しており培養可能な細胞を高収量で得られた。
- プロトコルの再現性と効率性が実証された。
- ダウンストリームのアプリケーションに適した調製が可能となった。
結論
- gentleMACS dissociatorは、肺組織の分散に有効です。
- この手法は、さまざまな組織型に適用可能です。
- 肺組織を研究する研究者にとって、有用なツールとなります。
よくある質問
産業上の重要性
標準化された組織解離は、免疫学および血管生物学の研究における極めて重要な前処理工程であり、ダウンストリーム解析に向けた一次細胞懸濁液の再現性のある調製を可能にします。gentleMACS Dissociatorは、マウス肺組織から生存率の高い単一細胞懸濁液を生成するための、自動化された低刺激かつスケーラブルな手法を提供し、フローサイトメトリー、セルソート、および分子プロファイリングにおける一貫したインプットをサポートします。この機能により、実験間での細胞回収量と生存率のばらつきが低減され、ターゲットバリデーション研究における予測の信頼性が向上します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 肺組織における白血球および内皮細胞集団の解析を可能にし、標的仮説の検証を実現する。
- 実用的価値： 組織処理における手作業のばらつきを抑え、研究室間や測定時点間での再現性を向上させる。
- 予測的価値： フローサイトメトリーおよびソーティングへの一貫した細胞入力をサポートし、表現型スクリーニング結果の信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 抗体染色やフローベースのアッセイに適した、デブリのないろ過済み懸濁液を調製します。
- 運用上の価値： 標準化された酵素消化と機械的解離により、細胞回収率のバッチ間の一貫性が確保されます。
- アッセイへの適合性： 磁気標識や細胞分離などのダウンストリームアプリケーションに適合する懸濁液を生成します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：肺組織における免疫細胞および血管細胞のダイナミクスを研究するための、疾患に関連したシステムを提供する。
- 前臨床モデルのサポート：マウス肺からの初代細胞の単離を可能にし、治療ターゲットの機序的なリスク低減を実現する。
- リスク調整済みの進展：信頼性の高い細胞調製により、前臨床ワークフローにおける一貫したバイオマーカー分析および機能的な検証をサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
gentleMACS Dissociatorは、組織採取から細胞解析までの間の標準化されたサンプル調製ステップとしてディスカバリーワークフローに組み込まれており、ex vivo組織からアッセイ可能な単一細胞への確実な移行を可能にします。
- 発見生物学： パスウェイ解析に向けた、肺に常在する免疫細胞およびストローマ細胞の仮説駆動型の分離をサポートします。
- スクリーニング： 免疫調節因子のハイコンテンツ解析またはフローベースの表現型スクリーニングに利用可能な、再現性の高い細胞懸濁液を提供します。
- 分析： 実験条件を比較するための、定量的なフローサイトメトリー読み取り（例：CD45+、CD31+）を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 標準化された調製を通じて、マウス肺モデルをヒトに関連する免疫細胞および内皮細胞研究へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 装置にプリセットされた肺プロトコルにより、肺炎症、線維症、または感染症を研究する複数のプロジェクト間で再利用が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 白血球および内皮細胞の高い生存率と純度は、ダウンストリームアプリケーションにおけるデータの質を向上させます。
- 運用上の価値： 自動化により、組織解離における手作業の時間とユーザーに依存するばらつきが減少します。
- 戦略的価値： 一貫した細胞回収率と生存率の指標に基づいた、Go/No-Go判断を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： バリデーションのための信頼性の高い初代細胞のインプットを提供することで、リスク調整後のターゲットの優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- 無菌的な組織切除および酵素処理に関するトレーニングが必要です。
- 肺専用プログラムとCチューブを備えたgentleMACS Dissociatorへのアクセスが必要です。
- ユーザー間で酵素濃度（Collagenase D、DNase）および緩衝液条件を標準化する必要があります。
- 組織密度に影響を与える異なるマウス系統、年齢、または疾患モデルに合わせて最適化が必要な場合があります。
- 酵素的解離に適した組織に限定されます。線維化または石灰化したサンプルには、機械的な代替手法が必要になる場合があります。
