パターニングの生体分子の微小電極上に自己組織膜を汚

この手順では、まずシリコン基板上にマイクロ電極を作製します。次に、微小管のファウリングを防ぐため、マイクロ電極と基板の上にポリエチレングリコール自己組織化単分子膜を形成します。その後、ルミニンで標識した微小管を調製します。

最後に、電気泳動を用いて、パターン化された電極上に微小管を配置します。こんにちは、テキサスA&M大学物理学科のNana研究室および生物医学工学科の分子バイオメカニクス研究室のJohn Noelです。私は物理学科のWil free Tezaで、テキサスA&M大学のCenter Skill Science and Technologyの責任者を務めています。

私はテキサスA&M大学バイオメディカル工学科、分子バイオメカニクス研究室のディレクター、Juan Quangです。本日は、非特異的吸着防止性の自己組織化単分子膜でコーティングされたマイクロ電極の作製手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、電気泳動による微小管の配向性を研究しています。

では、始めていきましょう。まず、スクライバーまたはウェハーカッターを使用して、シリコンウェハーを基板として用いるための1 cm × 1.5 cmのサイズに切断します。次に、基板を十分な量のアセトンが入ったビーカーに入れ、基板を乾燥させないように注意しながら5分間超音波洗浄して、基板を洗浄します。

それらを新鮮なアセトンで洗浄した後、直ちにイソプロパノールで再度洗浄し、窒素を用いて乾燥させます。標準的なポジ型フォトリソグラフィーまたは電子ビームリソグラフィーを用いて、洗浄済みの基板上に金マイクロ電極を作製します。パターン形状を設計する際は、各電極パターンの直径を100 microns未満に抑えてください。ポリエチレングリコールトリメトキシシラン自己組織化単分子膜（PEG SAM）によって確実に被覆されるように、パターンから300 to 500 micrometersの位置にコンタクトパッドを配置し、パッドと電極を1 millimeterのラインで接続してください。

レジスト層にパターンを形成した後、ピンセットを使用して、コンタクトパッドから基板端までレジストに線をひっかきます。金属堆積を行うことで、このひっかいた線が電極と基板端との間の電気的接点となります。金属層の堆積には、好ましくは2つのソースを備えた堆積チャンバーを使用します。

電極は、2 nmのクロムを堆積させた後、6 nmの金を堆積させることで形成します。真空を破ることなく、チャンバー内部に装備された水晶振動子マイクロバランスを用いて、堆積中の薄膜の厚さを測定することが可能です。次に、換気の良い場所で自己組織化単分子膜の調製を開始し、オーブンを75 °Cに予熱します。250 mLのガラスビーカーに20 mLのトルエンを入れ、そこに1 mLのpeg selineを加えて機能化溶液を調製します。

ピペッティングで5〜10回上下に混ぜた後、ピペットで30秒間攪拌し、十分に混合させます。パターンサンプルをパターン面を上にしてビーカーに入れ、サンプルが完全に溶液に浸かり、かつビーカーの底に均等に配置されていることを確認します。ビーカーをオーブンに入れ、SAMが形成されるまで18〜21時間焼き付けます。

22 by 50 mmのガラスカバースリップ上に、1 nmのクロムを蒸着させた後、4 nmの金を蒸着させて対極を作製します。対極は、薄い灰色またはピンク色を帯びたほぼ透明な状態である必要があります。汚れを防ぐため、対極はコーティング面を上にしてシャーレに保管してください。

オーブン内で18〜21時間経過した後、ビーカーをオーブンから取り出します。トルエンが蒸発し、パターン試料が粘性の高いPEGクリン残渣の中に残っているはずです。ビーカーにトルエン20 millilitersを加え、試料を1〜2分間浸します。

サンプルをビーカーから取り出し、トルエン、次いでイソプロパノールで洗浄し、最後に窒素で乾燥させます。この時点で、サンプルは清潔に見え、SAM層は肉眼では確認できないはずです。このように調製したSAMは、涼しく乾燥した条件下で保存した場合、最大2日間使用可能です。

SAM形成に失敗すると、表面に濁った、あるいは色むらのある残留コーティングが生じます。SAMの調製が完了したら、チューブリンの微小管への重合を開始します。まず、ラベルなしチューブリンとロドミン標識チューブリンを融解し、明るい微小管を得るために、ラベルなしとラベルありを2:1の比率で直ちに混合します。

ピペッティングを数回繰り返し、十分に混合させます。次に、37 °Cに設定した恒温水槽内で、tubulinを20〜40分間重合させます。その間に、20 µMのTaxolをpipee緩衝液に混合し、pipes Taxol緩衝液を調製します。

ピペッティングを数回繰り返し、ボルテックスで十分に混合した後、チューブを37 °Cの恒温槽に入れます。重合後、微小管を温めたTaxolバッファーで希釈し、遮光保存します。微小管の重合が成功していること、および数分間の蛍光励起下で微小管が安定していることを確認してください。

チューブリンの微小管への重合が完了した後、酸素捕捉剤混合液を用いて、調製した微小管をイメージングします。次に、電気泳動によるMTSのパターニングを開始します。まず、両面テープをガラススライドの上に置き、カミソリで細い帯状に切り出します。パターニングされたSAMコーティング試料に、電極がテープの間に位置し、接続パスがテープに対して垂直になるように、2本の両面テープを貼り付けます。

対極を両面テープの上に、金属面がテープに接するように配置し、サンプルの端が対極から約3 mmはみ出すようにします。被覆付き銅マグネットワイヤーを15 cmの長さに数本切り、両端の被覆を1 cm剥がします。少量の銀ペイントを用いて、基板の露出した金領域にワイヤーを固定します。その際、対極と電気的に接触しないように注意してください。

次に、銀ペーストを使用して、2本目の電線を対極に取り付けます。銀ペーストで取り付けた電極線は、テープを用いてサンプルにさらに固定することができます。続いて、ピペットを用いて、目的の希釈濃度の微小管を導入し、20倍の倍率でシリコンウェハー上のパターンを確認してから電圧を印加します。

フローチャンバーには深さがあるため、フローチャンバーの上表面をイメージングするには、作動距離の長い対物レンズが必要になる場合があります。試料表面からフローチャンバー上表面までの距離はテープの厚さによって決まり、約 60 to 100 micrometers になります。最大 1 volt の電圧を印加し、微小管の移動を観察します。

微小管の可逆的なトラッピングを目的とする場合は、マニキュアを用いてフローチャンバーを密封し、横方向へのドリフトを防止させ、電圧を約0.5 Vまで下げて使用してください。移動の追跡は、顕微鏡の垂直方向の焦点面を調整することで可能です。印加電圧を約0.9〜1.2 Vに設定すると、微小管が電極表面に局在します。

電圧を高くすると移動速度が上がり、接着が強くなりますが、電圧が高すぎると電気分解が誘発され、脱重合が起こります。微小管についてですが、SAMコーティングを施したマイクロ電極は微小管の吸着を防ぐため、ここでは微小管パターニングに向けたSAMコーティング済みマイクロ電極の作製方法を説明しました。この手順は、微小管的可逆的パターニングにも利用可能です。

さらに、このプロセスは微小管に限られたものではなく、一般的なバイオ分子のパターニングにも利用可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。