タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

本実験の全体的な目的は、タンパク質の吸着および細胞増殖を制御するための二次元パターン化基板を開発することである。これは、フォトリソグラフィーを用いてパターン化マスターを作製し、それを用いてマイクロコンタクトプリンティング用のA-P-D-M-Sスタンプを作製することで達成される。第二のステップとして、タンパク質を吸着する領域と排除する領域を持つパターンをマイクロコンタクトプリンティングにより形成し、パターン化金基板を調製する。

次に、パターンを可視化し検討するために、タンパク質と細胞を基板に添加します。蛍光顕微鏡および位相差顕微鏡による観察の結果、これらのパターン基板上でタンパク質と細胞が良好に封じ込められていることが、細胞の増殖と挙動から得られました。タンパク質のMicroConプリンティングなどの他の既存手法に対する本手法の主な利点は、グリコール末端モノレイヤーがパターンの背景におけるタンパク質や細胞の非特異的な吸着を抑制することです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、印刷する各パターンに合わせて適切なスタンプ技術を最適化する必要があるため、苦労することがあります。パターン化されたマスターセンターの作製を開始するには、スピンコーター上のシリコンウェハーを、2サイクルのスピンプログラムの最初のステップでアセトンでリンスします。スピンプログラムの2番目のステップでアセトンが蒸発し、ウェハーが清潔で乾燥した状態になります。スピンの開始時にウェハーにフォトレジストを塗布し、前述の条件でスピンコートを行います。

均一性の高いホットプレートを用い、フォトレジストを塗布したウェハを110 °Cで2分間ソフトベイクします。次に、マスクアライナシステムと適切なマスクを用いて、フォトレジスト塗布ウェハにフォトパターニングを行います。

まず、基板をマスクアライナの真空チャックの上に置きます。次に、マスクをホルダー 트レイに挿入し、真空をオンにしてマスクを固定し、マスクと基板が十分に密着していることを確認します。基板をマスクに接触するまで上昇させます。

アライナーの光学系を用いて、良好な密着が確保されていることを確認します。最後に、ランプを点灯させ、リソグラフィマスクを通して基板にUV光を照射します。パターン形成されたウェーハを、緩やかに攪拌しながら現像液中で1分45秒間現像します。

半導体グレードの脱イオン水で十分に洗浄し、窒素ガス流で乾燥させ、UVフィルター付きの顕微鏡を用いてパターンの現像状態を確認します。まず、重量比10対1の樹脂硬化剤を調製することからこの手順を開始します。Cigar 180 2を完全に混合してください。

使い捨てペトリ皿に入れた混合物でフォトパターンウェハを覆い、真空デシケーターで脱気し、PDMSで覆われたマスターから気泡が見えなくなるまで処理します。マスターが皿の底にあることを確認した後、オーブンを用いて65 °Cで1.5時間、スタンプを硬化させます。PDMSスタンプが硬化した後、マスターからスタンプを切り出し、適切なサイズにトリミングします。

埃やゴミから保護するため、スタンプは特徴面を上にして蓋付きの容器に保存します。金属蒸着用の基板を準備するには、まず円形ガラスカバースリップを酸素プラズマで10分間処理します。次に、カバースリップを脱イオン水で2回すすぎ、すすぎの間は窒素ガス流で乾燥させます。水ですすいだ後、さらにエタノールで2回すすぎ、同様にすすぎの間は窒素ガス流で乾燥させます。

マルチポケット電子ビーム蒸着装置を用いて、50 angstromsのチタンを蒸着させた後、150 angstromsの金を蒸着させます。チタン層と金層の蒸着の間に、蒸着装置内をベントしないでください。PDMSスタンプをエタノールで洗浄し、十分に乾燥させます。

窒素ガスを用いて、スタンプ全体が完全に覆われるまでスタンピング溶液を滴下します。窒素ガスでスタンプを十分に乾燥させます。HEXA Decaneファイルのマイクロコンタクトプリントは、PDMSスタンプの形状に依存するため、本手順の中で最も困難な工程の一つとなります。

スタンプを成功させるには、均一な圧力をかける適切な技術を習得する必要があります。スタンプ操作において、空気中での従来のマイクロコンタクトプリンティングを行う場合は、スタンプを金基板上に軽く押し付け、単分子層が形成されるまで15秒間保持してください。

あるいは、非常に微細な構造と高いアスペクト比で構成されるパターンの場合は、金基板を18.2 MΩの脱イオン水が入ったペトリ皿に入れ、基板が完全に浸かっていることを確認します。次に、スタンプを金基板の上にそっと押し当て、単分子層を15秒間形成させます。その後、スタンプを押した基板をエタノールで2回すすぎ、窒素ガスで乾燥させます。

各洗浄後、基質をシャーレに入れ、バックフィリング溶液で基質を覆います。蒸発を防ぐため、パラフィルムでシャーレを密閉します。暗所で12〜14時間静置し、バックグラウンド単層を形成させます。

最後に、パターン形成済みのカバーガラスを背面充填溶液から取り出し、エタノールで2回すすぎ、すすぎのたびに窒素ガスで乾燥させます。パターン形成済みカバーガラスにタンパク質を塗布するには、カバーガラスを小型のペトリ皿または細胞培養チャンバーに入れます。500 µLから1 mLのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で満たします。タンパク質のインキュベーション中、DPBSで基板全体を完全に覆う必要があります。

タンパク質の被覆を均一にするため、高濃度タンパク質溶液をDPBSに加え、ピペッティングで数回混ぜ合わせます。このタンパク質混合液を用いて、基質を37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、基質をDPBSで十分に洗浄して未結合のタンパク質を除去します。この際、基質を乾燥させたり、気液界面にさらしたりしないように注意してください。

3回の洗浄後、DPBSを吸引します。次に、基材を湿らせた状態に保つため、完全細胞増殖培地を約500 microliters加えます。基材の洗浄に使用した増殖培地を交換します。

新鮮な培地を用いることで、基板に細胞を播種する準備が整いました。通常、1平方ミリメートルあたり30〜200個の細胞を基板上に播種します。この画像は、APDMSスタンプのパターン面を下にしてガラスカバースリップ上に配置し、顕微鏡で観察した様子を示しています。スケールバーは100 µmです。

適切にスタンピングを行うと、LOR 6 47標識フィブロネクチンのような蛍光標識タンパク質を適用することで可視化できる、シャープで鮮明なタンパク質パターンが得られます。ここでは、chk one細胞がタンパク質パターン内に閉じ込められている様子を示しています。これらの画像におけるスケールバーは100 micrometersです。

あるいは、SU固定後のタンパク質パターンを可視化するために、免疫組織化学を用いることもできます。ここでは、LOR 647結合抗ラミニン抗体を用いて、E 18マウス海馬ニューロンを播種したパターン化ラミニンの可視化を行っています（in vitro 4日目）。MIT tracker red 580で染色したE 18マウス海馬ニューロンにより、細胞増殖がタンパク質パターン内に十分に限定されていることが分かります。この手法は容易に習得できますが、LOR 647結合フィブロネクチンの吸着によって可視化されたこれらのパターン基材の調製例に示されるように、いくつかの一般的な問題が発生することがあります。

濃縮タンパク質溶液をDPBSで十分に混合せずに塗布すると、タンパク質のパターンにムラが生じることがあります。また、スタンピングが不適切であると、パターンの転写不全やスタンプの崩壊を招く可能性があります。さらに、タンパク質を吸着させたパターン基板を空気にさらすと、単分子層が乱れ、抵抗値の低下を引き起こす恐れがあります。

背景として、液中パターニングを用いることで、従来の空気中でのマイクロコンタクトプリンティングでは困難な微細構造を持つパターンを作製できます。これら2つの画像は、同一のPDMSスタンプを用いて空気中または脱イオン水中でプリントした同一パターンの異なる領域を示しています。左側の画像にはサポートラインが表示されており、パターンの微細構造のみが正常にプリントされなかったことがわかります。スケールバーは 20 micrometers です。この手法を習得し、適切に実施すれば、18から24時間で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、パターン基板の作製方法について十分に理解することができます。PDMSスタンプを作製し、マイクロコンタクトプリンティングを用いて金パターン基板を調製し、タンパク質と細胞を用いてこのパターンを可視化します。