ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

こんにちは。私はカリフォルニア大学デービス校分子細胞生物学部のブルース・ドレイパーです。そして私はシアトルのフレッド・ハッチンソンがん研究センター基礎科学部門のセシリア・モーンズです。本日、私とセシリアは、ブライアン・ハーヴェイのオリジナルプロトコルを改良したゼブラフィッシュ精子の凍結保存プロトコルを実演します。2人1組のチームで作業することで、100匹の雄個体から2時間以内に精子を凍結保存できることをお見せします。

融解後の受精能には幅がありますが、平均して25%の受精能が得られています。これは7年以上凍結保存されていたライブラリーによる結果です。それでは、手順を開始しましょう。この操作を行う前に、まず精子凍結保存液を調製します。

Ginsburg魚類リンガー液は3日ごとに調製し、凍結保存液はメタノール含有および非含有のそれぞれを毎日調製します。これらの溶液の組成は、本プロトコルに付随するオンライン補足情報で確認できます。本手順で使用する材料は、凍結および融解の速度に影響を与える可能性があり、それが凍結精子の受精能に影響を及ぼすことがあります。

そのため、推奨される材料の一覧を補足的なオンライン情報として提供しています。精子はドライアイスのペレットではなく、細かく砕いたドライアイスで凍結させるのが最適です。ドライアイスを砕く簡単な方法の一つは、タオルに包んでハンマーで粉砕することです。

より効率的な方法は、Claws and Model RE2などのドライアイスグラインダーを使用してゼブラフィッシュの精子を凍結させることです。まず、10 µLキャピラリーチューブの底から約16.7 mm、または3.33 µLのレベルにラボペンで印を付けます。雄を麻酔させるため、トリカインを希釈した魚用水を含むビーカーに2〜4匹の雄を入れます。レシピはゼブラフィッシュの本に記載されています。

麻酔後、プラスチックスプーンで魚を麻酔液から取り出し、ペーパータオルでそっと水分を拭き取ります。特に腹側の水分除去に注意してください。水は精子を活性化させるため、造精腺周辺を完全に乾燥させることが極めて重要です。

魚の腹側を上にしてスポンジホルダーに配置します。腹鰭の周囲がまだ湿っている場合は、キムワイプで軽く拭き取ります。マークしたキャピラリーチューブを、チューブに付属しているラバー口ピペットアダプターに装着します。

アダプターは、片端にマウスピース、もう片端にキャピラリーホルダーを備えたゴム製ホースです。あるいは、キャピラリーチューブを50 µLのHamiltonシリンジに接続することも可能です。適切な直径の短いTygonチューブを用い、オスを顕微鏡下に配置し、骨盤鰭を慎重に広げて尿生殖腔を露出させます。

キャピラリーチューブの先端を用い、滑らかなピンセットで魚の側面に沿って優しくなでるか、人差し指と親指で魚の側面を軽く挟むことで精子を射出させ、緩やかに吸引してキャピラリーチューブに回収します。この際、精子とともに排出される可能性のある糞便が混入しないように注意してください。目標とする精子の回収量は3.3 microlitersです。

許容される精子の最小量は、精子の質によって異なります。質の良い精子は白濁していますが、質の低い精子は水のように見えます。一般的に、許容される最小量は、質の良い精子であれば 1 µL または目標量の3分の1、質の低い精子であれば 2 µL または目標量の3分の2となります。

精子の量が見出しの目標量である3.3 µLに達しない場合は、メタノールを含まない凍結保存液を用いて、ペンの印まで容量を調整する必要があります。精子の量がすでにキャピラリーチューブのペンの印に達しているか、またはそれを超えている場合は、次のステップに進んでください。次に、精子に凍結保護剤を添加します。

メタノールを含む凍結保存液をオレンジ色の印まで吸い上げます。このとき、概算の総量は 20 µL となります。精子と凍結保護剤の混合液を時計皿の清潔な箇所に吐き出し、ピペッティングで 4 回ほど緩やかに混ぜ合わせます。その際、気泡が入らないように注意してください。

ラベルを貼った各クライオバイアルの底に、精子凍結保存液を10 µLずつピペッティングし、精子を2本のクライオバイアルに分注します。迅速にバイアルにキャップをし、各クライオバイアルを別々の15 mLファルコンチューブに入れます。室温でファルコンチューブにキャップをし、微粉砕したドライアイスに挿入します。

ファルコンチューブを識別しやすくするため、キャップのみが見える深さまでチューブを挿入してください。チューブに番号を振り、それぞれのチューブをドライアイスに入れた時間を記録します。精子をドライアイスの中で20分間凍結させます。

精子を凍結後、2本のクライオバイアルを液体窒素が入ったデュワー瓶に移します。一時的に保存する場合、サンプルが加熱されないよう、フリーザーボックスを液体窒素バスに浸してください。

長い金属製トングを使用して、ドゥアー瓶からバイアルを回収し、クライオグローブを用いて取り扱います。あるいは、クライオバイアルをドライアイスから直接フリーザーへ移送することも可能です。長期保存のために、スタイロフォーム容器に入れた液体窒素にフリーザーボックスを浸漬させている場合は、クライオバイアルを液体窒素極低温フリーザーに保管してください。

精子の生存率を維持するためには、バイアルを液体窒素に浸して保存することが極めて重要です。気相で保存されたバイアルは、時間の経過とともに生存率が低下する可能性があります。また、精子の生存率を維持するには迅速な操作が不可欠です。凍結保護剤を添加してから精子バイアルをドライアイスに置くまでの時間は、体外受精において30秒以内にする必要があります。

凍結保存された精子を使用する場合、2人体制で行うのが最適です。1人が雌から卵を絞り出し、もう1人が精子を融解させます。恒温槽を33°Cに設定してください。

クライオバイアルを液体窒素フリーザーから取り出し、解凍の準備が整うまで液体窒素の入った容器またはフラスコに移します。麻酔をかけた雌から卵を35mmのプラスチック製ペトリ皿に搾り出します。この手順の詳細については、ゼブラフィッシュに関する詳細な記述がある、Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressureというタイトルのJoVEプロトコルで説明されています。

体外受精において、良好な卵塊は、均一で黄色みを帯びた卵を150個以上含んでいます。白い破片がある場合は、劣化を示しています。可能であれば、3つの卵塊を採取し、1つのディッシュにまとめてください。

最初のクラッチから1分以内に3つの良好なクラッチが得られない場合は、次のステップに進みます。精子が解凍されるまで、ディッシュに蓋をしたままにしておきます。その間に、バイアルを液体窒素から取り出し、キャップを外します。

バイアルの半分を33 °Cのウォーターバスに8〜10秒間、迅速に浸します。室温のHank's buffered salt solution 70 µLを迅速にバイアルに加え、ピペッティングで混ぜ合わせます。すぐにペトリ皿の中の卵に加えて、ピペットチップで静かに混ぜます。次に、魚用飼育水 750 µLを加えて精子と卵を直ちに活性化させ、旋回させて混ぜ、室温で5分間インキュベートします。

5分後、ディッシュに魚と水を加え、28 °Cでインキュベートします。2～3時間後、生存している胚を数え、1枚の100 mmディッシュあたり50個の割合で移します。また、精子サンプルの受精率を決定するため、受精卵の数もカウントしてください。

精子の受精能とは、体外受精に使用した卵子の総数に対する生存胚の割合のことである。卵子の選別は、体外受精から2時間から6時間後のいつでも行うことができる。受精しなかった卵子は生存胚と容易に区別でき、透明で未分裂の状態である。

実体顕微鏡の透過照明で観察すると、凍結保存された精子の平均受精率は大きく変動します。しかし、数年間にわたって安定した平均25%の受精率を得ることは可能です。このグラフは、2001年から2003年の間に凍結され、直近の2008年まで保存されていた精子の平均受精率を示しています。

私たちは、ゼブラフィッシュ精子の凍結保存のためのハイスループット法を実演しました。このプロトコルを行う際は、推奨されるすべてのプラスチック器具および設備を使用すること、ならびにドライアイスペレットではなく、粉砕したドライアイスを使用することが重要です。非常に高品質な精子と卵子を使用することが不可欠であり、体外受精で精子を播種させる際の卵子については、最終的に得られる受精胚の数を増やすために、できるだけ多くの数の卵子を使用することが重要です。これには、3〜4匹の雌が必要になる場合があります。

本プロトコルのもう一つの重要な要素は速度です。雄から精子を採取し、ドライアイスに入れるまでの時間は、1分を超えてはなりません。これで全てかと思います。

実験の成功をお祈りします。