ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

本手順は、高品質なRNAテンプレートから合成されたcDNAを用いて開始します。まず、cDNAを蛍光色素Cy3で標識します。標識反応の完了後、標識されたcDNAを精製・単離し、標識反応の品質を評価します。

次に、ラベル化されたCDNAをマイクロアレイにハイブリダイズさせます。ハイブリダイゼーション後、アレイを解析してサンプル中の遺伝子発現の相対レベルを決定します。こんにちは、私はパデュー大学保健科学部のJennifer Freeman博士の研究室のSam Petersonです。

これまでに、ゼブラフィッシュの胚からRNAを抽出し、そのRNAをcDNAに変換する方法について説明しました。本日は、グローバルな遺伝子発現プロファイルを解析するために、そのcDNAを標識し、ゼブラフィッシュ・オリゴヌクレオチドマイクロアレイプラットフォームにハイブリダイズさせる手順を紹介します。通常、この手順は毒性物質への曝露に対する遺伝子発現の差異を研究するために用いられます。

それでは開始しましょう。マイクロアレイ実験では、標識に使用される蛍光色素Cy3の光分解を防ぐため、最小限の光環境が必要です。まず、BioPrime Array CGH Genomic Labeling Systemの以下の構成成分を融解します：2.5x ランダムプライマーバッファー、10X dCTPミックス、およびヌクレアーゼフリー水。さらに、1 mMのCy3標識dCTPストック溶液を融解させます。融解後、各試薬を短時間遠心分離し、0.6 mLの厚壁チューブに混合します。

500 ngのCDNA 40 µL、2.5 x random primer buffer、およびヌクレアーゼフリー水を加え、全量を86 µLにします。十分に混ぜて短時間遠心分離した後、サーモサイクラーを用いて100 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション終了後、直ちに反応液を氷水混合液に移し、10分間冷却します。

次に、exo DNA polymeraseをフリーザーから取り出し、氷上に置きます。その後、反応チューブに10 X-D-C-T-P Mixを10 µL、1 mM SI 3D CTPを2 µL、およびXO cleanout DNA polymeraseを2 µL加え、よく混合して短時間遠心分離します。最後に、サーモサイクラーを用いて反応液を37 °Cで16時間インキュベートし、ラベル化を完了させます。

標識されたcDNAの精製および沈殿操作を行います。標識されたcDNAの精製を開始するために、MicroConカラムを1.5 mLチューブに入れます。

カラムに300 µLの0.1 XSSCを加え、続いて標識反応液を添加します。4 °Cで10分間、16,100 ×gでカラムを遠心分離します。この際、流出液が淡いピンク色になることがある点に注意してください。

フロースルーを捨て、さらに300 µLの0.1 X SSSCをカラムに加えます。その後、4 °Cで16,100 Gにて10分間、再度遠心分離を行います。再びフロースルーを捨て、さらに300 µLの0.1 X SSSCをカラムに加え、この最後の洗浄後、4 °Cで16,100 Gにて12分間遠心分離します。

流出液は透明であり、カラム上にはピンク色に標識されたCDNAが視認できるはずです。ここでも、標識CDNAを溶出させるため、この最終洗浄の流出液は廃棄します。カラムに100 µLのヌクレアーゼフリー水 adds してください。カラムをマイクロ遠心チューブから取り出し、新しいチューブに逆さまに挿入します。

次に、逆転させたカラムを 4 °C で 2,300 G で2分間遠心分離します。ラベル付き cDNA はチューブ底部の水に溶解しています。製造元の指示に従い、NanoDrop ND 1000 分光光度計を用いて、得られた cDNA を確認してください。

付属の書面プロトコルに記載されている通り、DNA濃度を算出し、色素の取り込みを評価します。cDNAが十分に標識されている場合は、6 µgを新しいチューブに入れ、0.1 ×量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）と1 ×量のイソプロパノールを用いて、標識cDNA混合物を室温で30分間暗所でインキュベートし、沈殿させます。

ここまでのすべての工程を、極力光を遮断した環境で実施したことを確認します。次に、サンプルを室温で16,100 G、20分間遠心分離します。遠心分離後、ピンク色のDNAペレットを乱さないように注意して、上清を慎重に除去します。

最後に、500 µLの70% ethanolを加えて洗浄し、緩やかに転倒混和した後、16,100 Gで5分間遠心分離します。室温で上清を除去し、チューブを逆さまにしてペレットを5分間乾燥させます。これで、ラベル化されたCDNAのハイブリダイゼーション準備が完了です。

ハイブリダイゼーションを開始する前に、NimbleGenハイブリダイゼーションシステムをオンにし、42 °Cまで平衡化させます。まず、標識済みCD NAペレットを5 µLのヌクレアーゼフリーウォーターに溶解します。付属の書面プロトコルに従い、Roche NimbleGen Hybridizationキットのハイブリダイゼーション成分であるHybridization buffer hybrid Aおよびアライメントオリゴを加え、全量を18 µLにします。

よく混ぜ合わせ、チューブを短時間遠心して内容物を底に集めます。次に、チューブを95 °Cで5分間保持し、標識したCDNAを変性させます。その後、アレイの準備が整うまで、チューブをNimbleGenハイブリダイゼーションシステムへ直ちに移動させてください。

マイクロアレイは慎重な取り扱いと保管が必要であることに注意してください。Roche NimbleGenアレイは、室温で乾燥剤とともに遮光して保管します。アレイをプレシジョンミキサーのアライメントツールにセットします。

PMA TにX oneミキサーをロードし、ピンセットで粘着ストリップを取り除きます。アレイとミキサーをロードした状態で、PMA Tをしっかりと閉じます。次に、PMA Tの穴を通してミキサーに圧力を加え、アレイとミキサーをPMA Tから分離させます。

最後に、ブライヤーを使用してミキサーの外周に圧力をかけ、アレイが密封されていることを確認し、気泡を取り除きます。次に、アレイミキサー複合体をハイブリダイゼーションシステムにセットして温め、CDNAサンプルをアレイにロードします。ディスプレイスメントポンプは、ゆっくりと一定の圧力をかけながら使用してください。

ラベル付けしたサンプル15 µLを、ミキサー中央の充填ポートに注入します。ポート穴から溢れた余分なサンプルを拭き取り、粘着テープで密封します。その後、ラッチを閉じます。

NimbleGenハイブリダイゼーションシステムのプログラムBを用いて、ハイブリダイゼーション溶液の混合を開始します。マイクロアレイを16～20時間ハイブリダイズさせます。ハイブリダイゼーションが終了に近づいた時点で、マイクロアレイの洗浄とスキャンを行います。GenePicks 4,000Bアレイスキャナーの電源を入れ、約15分間ウォームアップさせてスキャンに備えます。

次に、付属の書面プロトコルに従って、洗浄バッファー1A、1B、2、および3を準備します。洗浄バッファー1Aを42°Cに予熱し、その他のバッファーは室温のままにしておきます。洗浄バッファー1Aが温まったら、それをディッシュに注ぎます。

スライドラックを洗浄バッファー1 Bに浸します。次に、NimbleGenハイブリダイゼーションシステムからアレイミキサー複合体を取り出し、ジグにスライドさせます。あらかじめ温めておいた洗浄バッファー1 Aにアセンブリを浸して洗浄を開始し、スライドから剥がすようにして慎重にミキサーを取り除きます。その後、アレイをジグから取り出し、洗浄バッファー1 Aの中で15秒間振とうします。速やかにアレイを洗浄バッファー1 Bに浸したスライドラックに移し、スライドラックを2分間激しく振とうします。

次に、スライドラックを洗浄バッファー2に移し、1分間振盪します。最後に、スライドラックを洗浄バッファー3に移し、15秒間振盪します。アレイをスライド乾燥遠心機に移し、2分間遠心分離して洗浄工程を完了します。

Dは光やオゾンに敏感であるため、直ちにアレイをスキャンしてください。まず、アレイをバーコードを下にしてgene picks 4, 000 Bアレイスキャナーにロードし、スキャンを開始します。ハードウェア設定ダイアログボックスで、532 nanometerレーザーのPMT値を500に、パワーを100%、ピクセルサイズを5 microns、平均化ライン数を1、フォーカス位置を0 micronsに設定します。セットアップが完了したら、アレイのプレビューを確認してください。

スキャンする領域を選択し、スキャンを行います。スキャン完了後、画像のヒストグラムを確認してください。理想的には、1 E-5 正規化カウントが 65,000 の飽和限界に達しており、これは特徴量の約 1～2% が飽和していることを意味します。

正規化カウントが1 E-5未満の場合は、PMTゲインを上げてスライドを再スキャンしてください。正規化カウントが1 E-5を超える場合は、PMTゲインを下げてスライドを再スキャンし、画像を保存して、データ解析プログラムを用いてデータの正規化および強度値の算出を行ってください。このラベル化反応では、通常少なくとも10 µgのラベル化cDNAが得られます。

染料の取り込み量は、ヌクレオチド対SI 3の比がA 260対A 550の比に23.15を乗じたものに等しいという、単純なベース染料比を用いて算出できます。良好な反応では、値が50から80の間になります。許容可能なハイブリダイゼーションでは、機能的部位の1～2%が飽和します。

65,000の飽和リミットにおいて、1E-5の正規化カウントとなります。PMT値を500付近に設定した状態で、マイクロアレイのスキャン画像を確認し、アライメントされたオリゴヌクレオチドの強度をアレイ上の他のフィーチャーと比較することで、ハイブリダイゼーションの品質を定性的に評価することも可能です。また、スキャン画像を確認し、アレイ領域内に特異的なスポットやダストスポットがないかも評価する必要があります。

その後の解析では、散布図を用いて解析データを可視化し、サンプル間の遺伝子発現の相対的なレベルを決定し、差次的に発現している遺伝子を特定することができます。差次的に発現している遺伝子は、最適適合線から大きく逸脱します。補完的な手順として、ゼブラフィッシュ胚からRNAを抽出し、cDNAを合成する方法を説明しました。ここでは、グローバルな遺伝子発現プロファイルを研究するために、オリゴヌクレオチドマイクロアレイプラットフォーム上にcDNAを標識しハイブリダイズさせる方法について説明しました。

この手順を行う際は、常に高品質なCD NAを使用し、サイト3色素を直射日光にさらさないように注意してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。