エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス

こんにちは。ペンシルベニア大学細胞・発生生物学部のShannon Fisher研究室のエリカ・Kgiです。同じくFisher研究室のクリス・ウェーバーです。そして、シャノン・フィッシャーです。

本日は、ゼブラフィッシュのトランスジェニック解析を用いたエンハンサーエレメントの機能解析の手順をご紹介します。我々はこの手法を用いて、骨格形成において重要な遺伝子の転写調節について研究しています。それでは始めていきましょう。

候補遺伝子の周囲にある非コード配列を特定するために、uc SCゲノムブラウザのトラックとして利用可能なfast consアルゴリズムを使用します。私たちは主に骨格形成中に発現する遺伝子に関心を持っていますが、同様の手法を用いて、初期発生時に発現するあらゆる遺伝子を研究することが可能です。ここに示す例では、保存配列を特定しています。

ヒトbumper遺伝子の周辺領域において、隣接する遺伝子までの全領域を精査し、非コード配列の上位約5%に相当する低サイズ特異的ログスコアのカットオフ値を決定します。配列を選択後、Primer3を用いて、ヒトゲノムDNAから各配列を増幅するためのプライマーを設計します。プライマーは、保存領域およびその両側に30塩基以上の領域を増幅するように選択する必要があります。高品質なポリメラーゼを用いてヒトゲノムDNAから目的領域を増幅し、標準的な実験室分子生物学的手法を用いて、増幅産物を発現ベクターにクローニングします。

本プロトコルで使用するベクターは、PG wc FOS GFPA gatewayです。これはデスティネーションベクターであり、ベクター作成後に転座させることが指示されています。

転移に必要とされる酵素は、実験的な注入に先立ち、Ambion社のM message M machine kitとPGB 600プラスミドを用いてin vitroで転写されます。転移酵素の各バッチの有効性を、mouse socks. 10 enhancerなどの既知のエンハンサーを用いて注入し、テストしてください。

注入の準備として、Sutter P 97 マイクロピペットプラーを用いて、外径 1.2 millimeter のフィラメントキャピラリーガラスからマイクロインジェクション用の針を作製します。カミソリの刃とマイクロメータースライドを用いて、無傷の卵殻（corion）を貫通できる、鋭いテーパーを持つ強固なチップが得られるプログラムを使用してください。ステレオ顕微鏡下でチップを手で折り、外径を約 15 micrometers に調整します。

針はカバー付きの保持皿に入れて1日保存することが可能です。マイクロインジェクションを行う前日は、標準的な条件下で14時間の明期を含む通常の明暗サイクルでゼブラフィッシュを飼育します。タイミングを合わせた交配を行うため、小型の繁殖タンクで魚を準備します。

マイクロインジェクションを行う日の朝、明期の開始直後に、1水槽あたり雌3匹または雄2匹を平行な列に配置します。産卵させるため、洗浄済みのシステム処理水中で雄と雌を合わせます。魚の状態を頻繁に確認し、産卵後数分以内に卵を回収して、同期性の高いバッチを得ます。

午前中を通して、ラテックスバルブを装着した外径5.25インチの広口ガラスパステールピペットを用いて、新鮮な魚の群れを順次合わせていくことで、2〜3時間卵の生産を維持します。回収した胚を、胚培地を部分的に満たした60 × 15 mmのシャーレに50個ずつに分けて振り分けます。各シャーレの蓋に回収時刻を記入してください。

採取した胚の各クラッチについて、卵の採取ごとに50個の胚を1つのディッシュに保存し、未注射のコントロールとして使用します。マイクロ遠心チューブに以下の成分を混合して新鮮な注入液を調製し、氷上で保存します。注入針を保持ディッシュに置き、1.5〜2 µLの注入液を満たします。

各針の太い端に500 nanoliterの液滴をピペッティングします。これにより、毛細管現象によって液体が先端まで吸い上げられます。各注入溶液につき、少なくとも2本の針を準備してください。

充填済みのニードルを、窒素タンクに接続しメーカーの指示通りに設定した空気圧式ピコポンプまたは同様の圧力注入器のハンドヘルドニードルホルダーに装着します。マイクロメータースライド上のミネラルオイル中に放出された液滴の直径を測定して注入量を校正します。通常、注入時間は120 millisecondsに設定します。

20 PSの圧力で、実体顕微鏡を6〜10倍に拡大して使用し、約1ナノリットルの液滴を滴下します。微細ピンセットで胚を固定し、1細胞期または初期2細胞期の胚の絨毛膜を通して卵黄まで、一定の圧力で注入針を押し込みます。針先を胚盤胞の直下の卵黄に配置し、約1ナノリットルの注入溶液を排出した後、針を抜きます。各コンストラクトにつき200個以上の胚に注入します。注入完了後、未受精卵、損傷した胚、注入に失敗した胚、または胚盤胞にフェノールレッドが見られない胚を取り除き、胚を選別します。

その後、胚と胚培養液を28.5 °Cでインキュベートし、観察に適した時間まで待ちます。ここで、ゼブラフィッシュ胚において組織特異的なGFP発現パターンを生じさせるエンハンサーエレメントの代表的な結果を示します。私たちは、骨または軟骨で発現する遺伝子について研究しています。

こちらは、受精後3日目の頭蓋顔面軟骨における発現を制御する、acan遺伝子の上流にあるエンハンサー要素の例です。次に、骨細胞における発現を制御するbumper遺伝子由来の別のエンハンサーを示します。受精後5日までに私たちが同定した多くのエンハンサーにおいて、遺伝子に対する相対的な位置と発現制御との間には、ほとんど相関が見られません。

テストする配列を選択する際は、エンハンサーが遺伝子から数百キロベース上流または下流に位置する場合や、この胚に見られるようにイントロン内に位置する場合があることを留意することが重要です。かなりの割合の配列は、組織特異的な発現を制御していないと考えられます。これらは多くの場合、蛍光がほとんど認められないか、あるいは異所性発現の一般的な部位である表皮および骨格筋の2か所に、少数の細胞が散在して認められることがあります。

これまで、配列保存性を通じて潜在的なエンハンサー要素を特定し、ゼブラフィッシュのモザイク・トランスジェネシスを用いてその機能を検証する方法について説明しました。この手順を行う際は、インジェクションに使用するDNAおよびRNAの品質を確認することが重要です。また、特に少数の細胞群でのみ発現が予想される場合は、インジェクションしたすべての胚を注意深く観察するようにしてください。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。