のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

Drosophila melanogasterの発生中の器官の再構成を行うには、蛹の内部における光の伝搬を最も適切に記述する前方モデルを決定する必要があります。まず、白色の前蛹を選択し、蛹の前後の軸がキャピラリーチューブと平行になるようにチューブの端に接着します。少量の蛍光色素を満たした小さなキャピラリーチューブを、蛹の殻の中に挿入します。

慎重に軸調整を行った後、蛹を360度回転させます。異なる角度で画像を収集します。取得した蛍光透過照明データを用いて、器官の発達をイメージングするためのフォワードモデルを決定します。

こんにちは、私はマサチューセッツ総合病院ハーバード医学部、センター・フォー・アシスタンス・バイオロジーのClaudiaです。ハーバード医学部パラマウント研究室のUla Petouです。そして、ミュンヘン工科大学およびヘリマンセンター・ミュンヘンの生物医学イメージング研究所のDaniel Rozanskiです。本日は、Oph Melano Castaの全身を3次元再構成する手順をご紹介します。

当研究室では、蛹の状態における器官の発達をin vivoで可視化するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。開始する前に、光学投影トモグラフィーの技術的な詳細について、本動画よりも詳しく説明した、事前に視聴すべき付随動画は存在しませんのでご注意ください。

さらに、別のビデオでは、作製した大型動物の組織または器官のイメージングについて解説しています。このビデオで扱うすべての実験では、ショウジョウバエのトランスジェニック系統を使用します。それらは、唾液腺で発現するEL A gal four、成虫の翅および胸部の幼虫前駆組織で発現するapteris gal four、そして蛍光タンパク質を生成するトランスジーンです。

gal4駆動のUAS-GFPおよびwhite 1118を保持し、蛍光を発しないコントロール雄（UASトランスジェン保持）を、GAL4トランスジェンを保持する処女雌と交配させ、組織特異的なGFP発現を実現させます。交配は、少量のパン酵母を散布した標準ハエ培地を用いて、8〜10匹の処女雌と雄で行います。バイアルは、12時間明暗サイクルの加湿インキュベーター内、25 °Cで維持します。

交配開始の2日後、親個体を新しいバイアルに移します。その後5〜6日が経過すると、PUIがPrepUとともにバイアル内に現れ始めます。蛍光解剖顕微鏡下で、GFP発現個体を選択します。白いpre PUIを選択することで、個体が約1時間の間白いままであるため、動物の正確なステージングが可能になります。

蛹化の後、それらは色素沈着し、茶色になります。GFPを発現している蛹を濡れた筆を用いてバイアルから慎重に回収し、ペトリ皿内の水またはPBSの一滴の中に置きます。この際、自家蛍光物質が付着していないよう、きれいに拭き取りなければなりません。筆を用いて、これでトモグラフィーイメージングの準備が整います。

PrepUを正しい発生段階まで成熟させる必要がある場合は、濡れたペーパータオルを入れたペトリ皿か、清潔な保存容器に入れておきます。これにより、イメージングに必要な十分な湿度と適切な発生が確保されます。次に、PrepUを直径800 µmのガラスキャピラリー管の内壁に付着させます。

前蛹の後端にシアノアクリレート系接着剤を塗り、ハエの前後の軸がチューブと平行になるように、接着面をチューブに向けて配置します。個体の前部はキャピラリーチューブから突き出した状態になります。これで、キャピラリーチューブを顕微鏡の回転ステージに固定します。

垂直方向で、回転ステージの傾斜軸を調整し、チューブの回転軸がイメージングCCDのピクセル列と平行になるようにします。フライの位置を微調整した後、イメージングに進みます。この例では、唾液腺に蛍光を発する個体をイメージングします。唾液腺でGFPを発現する個体は、EAG four株とU-A-S-G-F-P株を交配させることで作製できます。

固定した前蛹から開始し、励起光で前蛹を照射してGFP蛍光信号を収集します。透過照明では、前蛹を垂直軸に沿って360度回転させ、透過照明画像を取得します。各画像は10度の回転に対応しています。

総取得時間は、蛍光量および励起ビームの強度によって異なります。一般的な所要時間は1分程度です。本例では、翅の成虫原基にGFPを発現しているDSO蛹をイメージングします。

この蛹は、Aus GAL4系統とUAS-GFP系統を掛け合わせたバイアルから採取できます。前蛹は既述の方法でマウントします。ただし、本実験のイメージング時間は約8時間であるため、脱水や個体の死を防ぐために、環境を室温かつ高湿度に保つことが極めて重要です。また、目的組織内の蛍光色素の消光を防ぎ、レーザー光による個体の焼損を回避するために、励起光にシャッターを設置します。以前と同様に、励起光で照射し、透過照明によってGFP蛍光信号を収集してください。

前蛹を垂直軸に沿って完全に回転させます。データ収集における回転時間はわずか1分であり、異なる時間間隔で繰り返し行われます。発生中の翅のタイムラプス画像シリーズを作成するには、1時間あたり100枚の割合で、少なくとも6時間にわたってデータを取得できます。

損傷や光退色を防ぐため、このシャッターを用いて全光量曝露を制御することが不可欠です。この動画では、PrepUステージと瞳孔頭部回避の間に取得された画像を示しています。3次元画像を再構成する際、拡散では近似できない強力な前方散乱が発生するため、これを考慮する必要があります。

したがって、再構成を行うには、光伝搬の前方散乱モデルを決定する必要があります。簡略化のため、吸収は無視します。散乱量は実験的に検証します。これを行うために、標準的な蛍光を持つ異物を非蛍光性の白い1118前蛹に挿入し、スキャンして前方モデルデータを生成します。まず、100 micronのシリカキャピラリーチューブにPS 5.5蛍光染料を満たすことから始めてください。

毛細管現象を利用して、前軸に対して45度の角度で毛細管を蛹に刺入し、PrepUを毛細管にマウントして、前述のように回転ステージ上の適切な位置に配置します。次に、低開口数レンズを用いて励起レーザービームで前蛹を照射し、前蛹の蛍光透過照明画像を収集します。前述の通り、MATLABソフトウェアを使用して、データを明示的な理論的前方モデルに適合させます。再構成プロセスを容易にするため、前方散乱領域を記述し、かつ実験データにも適合する輸送方程式の拡散近似を選択します。

適切なフォワードモデルを決定した後、唾液腺を再構成し、タイムラプス・トモグラフィー再構成画像を得ることができます。自由空間トモグラフィーを使用する場合は、屈折率整合のための構成アルゴリズムを設定することも可能です。まず、発生初期における唾液腺の3D再構成を示します。

比較として、唾液腺の組織学的染色を行うと、再構築結果が組織像とよく一致していることがわかります。翅原基の発生に関するこのタイムラプス動画は、単一の生存個体から取得されました。比較のため、同じ時点における翅原基の組織学的染色を行うと、再構築結果が組織像とよく一致していることがわかります。

私たちは、ショウジョウバエの生体内で、三次元構造を時間経過とともにイメージングするためのシステムの構築方法を説明しました。これにより、Drosophilaの形態形成を追跡し、6時間連続して翅の発達を観察することが可能になります。この手順を行う際は、ショウジョウバエ体内における光伝搬の適切なフォワードモデルを選択することが極めて重要です。

本手法は組織学的手法と組み合わせて使用することで、oph pupil stageにおける器官の発達を解明することができ、また、同様のサイズの異なる生物の研究に向けて最適化することが可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。