蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

こんにちは。私はウィスコンシン血液センター血液研究所でフローサイトメトリーを専門としているホープ・キャンベルです。こんにちは、私はボニー・ディーター博士の研究室の大学院生であるSTR Basoです。私もウィスコンシン血液センター血液研究所に所属しています。

本日は、蛍光活性化細胞分取法（FACS）を用いて細胞を単離する手順について説明します。この手法は、研究室においてリンパ球および骨髄系細胞集団の機能を研究するために用いられます。それでは始めましょう。

本手順では、マウスの脾細胞からB細胞およびCD4 T細胞を精製します。標的細胞の開始数は、必要細胞数と本手法を用いた装置の回収率に基づいて算出してください。B細胞およびCD4 T細胞の一般的な回収率は85～90%です。開始時の脾細胞集団は、約60～70%がB細胞、20～30%がT細胞です。

したがって、100 × 10⁶ 個の細胞から開始した場合、 FACS を開始する前に 50～60 × 10⁶ 個の B 細胞と 20～30 × 10⁶ 個の T 細胞を回収することができます。プロトコルに必要な溶液および試薬は氷上に置いてください。これらには、3% ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で構成される染色バッファー、3% ウシ胎児血清を含む Hank's 平衡塩溶液（HBSS）で調製した 25 mM HEPES 懸濁バッファー、ウシ胎児血清で調製した 25 mM HEPES 溶液、染色抗体、およびコンペンセーションビーズが含まれます。

このプロトコルでは、以下の備品および試薬も必要です。15 mL コニカルチューブ、12 × 75 mm ポリスチレンまたはポリプロピレン製フローチューブ。ナイロン製セルストレーナー、トリパンブルー、および血球計数器。また、これを実施するために、ソート回収チューブをあらかじめ準備しておく必要があります。

300 µLのHEPES FCS溶液をフローチューブに、または1 mLのHEPES FCS溶液を15 mLコニカルチューブに分注します。これらは回収プロセスが始まるまで氷上に置いてください。まず、目的の細胞集団の単一細胞懸濁液を調製することから開始します。

この手順で単離した細胞を培養する場合、すべての細胞調製操作は組織培養フード内で行ってください。無菌操作を用いて、氷冷した染色バッファーを加え、チューブを数回反転させて細胞を再懸濁し、1回洗浄します。

次に、細胞を4°C、約250 ×gで7～8分間遠心分離します。洗浄条件は細胞の種類や濃度によって異なります。サイトカインについては、200 × 10⁶個までの細胞を10 mLの染色バッファーで洗浄してください。

細胞ペレットを損なわないように、吸引によって上澄みを慎重に除きます。次に、氷冷した染色バッファーを用いて、細胞濃度が100 µLあたり最大50 × 10⁶個となるように細胞を再懸濁します。チューブを弾くか、あるいは穏やかにボルテックスして細胞ペレットを再懸濁してください。

次に、6つのセルのうち0.25から1×10の細胞を、氷上の新しい12×75 mmポリスチレンまたはポリプロピレン製フローチューブに移します。これを、後の未染色コントロールサンプルとして取り分けておきます。最初のチューブに、目的の最終濃度になるように一次抗体を細胞懸濁液に添加します。ここでは、B細胞を染色するためにPE-Texas Red標識anti-B220抗体を使用し、T細胞を染色するためにZE-conjugated anti-TCRβおよび/または700標識anti-CD4抗体を使用します。チューブの底を軽く叩くか、静かに混ぜ合わせます。

ボルテックスした後、細胞を氷上に置き、暗所で20〜30分間インキュベートします。インキュベート後、ラベル化した細胞をResusで洗浄します。具体的には、氷冷した懸濁バッファー10 millilitersに懸濁し、前述と同様に遠心分離を行い、上清を慎重に取り除きます。この操作を繰り返し、細胞を2回洗浄します。

最後に、氷冷した懸濁バッファーで細胞を再懸濁します。一次抗体が蛍光色素に直接標識されていない場合は、標識二次抗体またはストレプトアビジン共役体を細胞懸濁液に加え、再度、氷上で暗所にて20～30分間インキュベートします。その後、氷冷した懸濁バッファーで細胞を2回洗浄します。

氷冷した懸濁バッファーで細胞を再懸濁した後、トリパンブルーなどの生存染料と血球計数器を用いて、細胞濃度と生存率を測定します。分離中に死滅した細胞の凝集塊によるフローサイトメーターの詰まりを防ぐため、懸濁バッファーを添加して細胞濃度を10〜20 × 10⁶ cells/mLに調整します。

手順および染色。ソーティングプロトコルを開始する直前に、ドリップストレーナーで細胞をろ過します。ストレーナーの孔径は細胞の種類に応じて選択してください。サイトクリン（cytes）の場合は、孔径 40 µm のストレーナーを使用します。

液量に応じて、ろ過した細胞を15 mLコニカルチューブまたは12 × 75 mmフローチューブに回収します。ソーターの分取手順のセットアップが行われる間、細胞を氷上に置きます。BD comp beadsを単色ポジティブコントロールとして使用する場合は、アッセイで使用する各色につき1本のコントロールチューブと、未染色のネガティブコントロールチューブを1本準備します。

ビーズ懸濁液を十分にボルテックスした後、使用する各色のチューブおよびネガティブコントロールの100 µL懸濁バッファーに、ネガティブビーズ懸濁液とポジティブビーズ懸濁液をそれぞれ1滴ずつ加えます。次に、各ポジティブコントロールチューブに標識抗体を1 µL加えます。本実験では、PE Texas Red B 20抗体を用いて1本のチューブを調製します。

fit ETCR beta抗体を用いたものとlor 700 CD four抗体を用いたものをそれぞれ1本ずつ用意し、チューブの底を軽く叩いて（フリッキングして）混合した後、室温の暗所で15～30分間インキュベートします。染色バッファー2 mLでビーズを1回洗浄し、200 Gで10分間遠心分離します。上清を吸引して除去し、ビーズペレットを200～500 µLの染色液に再懸濁します。

フローサイトメーターのバッファー設定はメーカーによって異なるため、適切にトレーニングを受けた担当者のみが行ってください。本細胞分取手順では、BD FACS Ariaを使用します。分取を開始する前に、分取する細胞の種類に応じて適切なノズルを選択してください。

FACTSの利用可能なノズルサイズは、70 µm、100 µm、130 µmです。ノズルサイズは、ソートする細胞のサイズの少なくとも3倍である必要があります。リンパ球の場合は、70 µmのノズルを選択します。装置の無菌ソートオプションを使用することで、無菌的な細胞ソートが可能です。

このオプションを使用し、製造元の指示に従ってシース経路全体を70% ethanolで除染します。シースフィルターを交換し、PBSを滅菌済みのPBSに交換してください。サイトメーターの準備が整ったら、heaps FCSを含む、あらかじめ冷却した回収チューブを適切な回収デバイスにセットします。

利用可能な回収デバイスには、15 mLコニカルチューブを最大2本、または12 × 75 mmチューブまたはマイクロチューブを4本まで保持できます。1.5 × 10⁶個未満の細胞を回収する場合は12 × 75 mmチューブを、1.5 × 10⁶から4.5 × 10⁶個の細胞を回収する場合は15 mLコニカルチューブを使用してください。

適切な回収容器をソート回収チャンバーに設置します。マルチカラーソートを行う場合は、サイドストリームが設置した回収容器に向くように調整してください。まず、検出器間のスペクトルオーバーラップを補正するために、サイトメーターのキャリブレーションを行います。

ここに示されている例は、Fit C および PE の蛍光放出スペクトルの重なりを示しています。濃い影で示されたこの重なりはスピルオーバーと呼ばれます。ここでは、PE のスピルオーバーが Fit C チャネルで検出され、Fit C のスピルオーバーが PE チャネルで検出されることになります。

もう一方のチャンネルにおける蛍光の漏れ込み（スピルオーバー）による残留蛍光を排除するためには、このスピルオーバーを補正する必要があります。この補正プロセスをコンペンセーションと呼びます。手動でコンペンセーションを行うには、サイトメトリーソフトウェアを使用して、前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）を表示する2変数プロットと、使用する各蛍光色素ごとのヒストグラムを含むテンプレートを設定してください。

これらのプロットを設定する方法は、使用するソフトウェアによって異なります。ネガティブコントロールのチューブをサイトメーターのローディングポートにセットし、サンプルのランに合わせてデータ収集を開始します。FSCおよびSSCを調整し、目的の細胞集団がスケール内に収まるように設定します。

次に、陰性集団または自家蛍光がヒストグラムの左端に来るように、蛍光PMTの設定を調整します。陰性コントロールチューブを記録します。サイトメーターのローディングポートから陰性コントロールチューブを取り外し、最初の陽性コントロールcomチューブと交換します。

ここでデータ収集を開始します。このプロセスを各ポジティブコントロールチューブに対して繰り返し、チューブごとのデータを記録します。各ポジティブコントロールについて、ヒストグラムに記録されたイベントを囲むインターバルゲートまたはボックスを描画します。

次に、ヒストグラムの陰性領域に別のインターバルゲートを描画します。手動補正を行う際は、陽性群の中央値が陰性群の中央値と等しくなるまで調整し、実験で使用した各蛍光色素を考慮してください。中央値を調整するには、各蛍光パラメータの中央値が可能な限り一致するまで、スペクトルのオーバーラップ値を上げて、または下げて調整します。

陽性および陰性コントロールサンプルで設定した条件を用いて、実験サンプルのゲート設定を決定し、ソーティング手順の準備を行います。ソーティングする細胞が入ったチューブをサイトメーターのローディングポートにセットし、毎秒9,000〜10,000イベントの速度でデータ収集を開始します。前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）を表示するドットプロットを選択してください。

前方散乱光（Forward scatter）は細胞サイズの一般的な指標でありx軸に、側方散乱光（side scatter）は細胞の顆粒性の指標でありy軸に配置されます。次に、目的の細胞集団をゲートします。ゲートが決定したら、サイトメーターのロードポートの温度が4 °Cに設定されていることを確認してください。

次に、実験用サンプルチューブをローディングポートにセットします。ソートオプションを押し、回収を開始します。回収チューブは、充填されるに従って氷上に置いてください。目的の細胞数が回収されるか、またはサンプルチューブが空になるまでソートを継続します。

次に、ソートボタンを再度選択してソートを停止し、ローディングポートからサンプルを取り出します。続いて、回収チューブをサイトメーターのローディングポートに直接配置し、500～1000イベントを取得します。T細胞のソートに用いた設定と同じ設定を使用した場合、ソート手順によって純度は21%から99%に向上しました。B細胞の場合、ソート前のB細胞集団は5%でしたが、ソート後は98%に増加しました。

以上で、FACSを用いてサイトカインからB細胞およびT細胞集団を精製する方法について説明しました。単一細胞懸濁液を作成でき、適切な抗体が入手可能であれば、FACSを用いてあらゆる細胞集団を精製できることを覚えておいてください。さらに、蛍光マーカーを遺伝的に導入した細胞は、抗体を使用せずに容易に精製することが可能です。

また、実験には常に適切なコントロールを用い、正しいフルオロクロムを使用しているかフローサイトメトリーのレーザー構成を必ず確認してください。そして、各集団を適切に囲めるよう、適切なゲートを設定してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。