大動脈リングアッセイ

大動脈リングアッセイの全体的な目的は、3Dマトリックス内でマウス大動脈の組織片から血管を新生させる、柔軟な実験系を提供することです。まず、マウスから胸部大動脈を摘出し、周囲に残っている組織を慎重に除去します。その後、清浄化した大動脈のスライスまたは大動脈リングを、ドーム状に形成した基底膜抽出物（BME）を含む48ウェルプレートの各ウェルに配置します。

BMEをさらに1滴加えることで、リングを3D構造の中に封入します。マトリックスには、任意の実験用試薬を含めることができます。数日間インキュベートした後、大動脈リングから血管が発芽しているかを確認し、試験化合物の血管新生能を評価することができます。

こんにちは。イスラエルのベエルシェバにあるベオン大学ネガティブ学部、E. Lewis博士の研究室のカレン・ベインです。本日は、マウス大動脈リングアッセイの手順をご紹介します。当研究室では、様々な物質が血管形成に及ぼす影響を研究するために、この手順を用いています。

それでは、始めていきましょう。この手順を開始するために、基底膜抽出物（BME）を氷上または4°Cで解凍します。解凍後、BMEが再び凝固するのを防ぐため、冷やしたまま保持してください。

実験当日に、6〜7週齢のマウスを標準的なケタミンおよびキシラジンの注射により安楽死させ、頸動脈から迅速に採血した後、頸椎脱臼を行います。まず、滅菌済みの層流クリーンベンチ内で、動物の体を70%エタノールで拭いて処置を開始します。次に、解剖顕微鏡下で、滅菌鉗子と解剖用ハサミを用いて皮膚を垂直に切開し、腹壁を開きます。

切開を行い、肋骨を切り、横隔膜を除去して胸骨上部を露出させます。慎重にすべての臓器を脇に押しやり、脊髄に沿って位置する胸部大動脈を完全に露出させます。大動脈が露出したら、大動脈と脊髄の間に細い滅菌ピンセットを挿入します。ピンセットを広げて大動脈を緩やかに持ち上げ、胸部セグメントを大動脈の残りの部分から分離させます。

大動脈を分離させた後、鋭い鋏を用いて、腎血管に近い末端から心臓付近に向かって、マウスから大動脈を切り出します。切り出した胸部大動脈を、冷やした滅菌PBSを満たしたペトリ皿に入れます。大動脈を摘出した後、2本の滅菌ピンセットを用い、実体顕微鏡下で大動脈リングを調製します。

胸部大動脈から周囲の脂肪組織を除去します。大動脈を損傷させないよう注意し、端の部分のみを持って操作してください。完全に洗浄されるまで、脱水を防ぐために大動脈をPBSの入ったペトリ皿に繰り返し浸してください。

胸部大動脈の洗浄が終わったら、外科用メスを使用し、実体顕微鏡下で大動脈を1 mm間隔のリング状に均等に切断します。切断面の下に定規を置いてガイドにし、切れ味を維持するために新しいメスを使用し、適宜交換してください。大動脈の両端は使用しません。各リングを切断した後、ピンセットを用いて、冷PBSを入れた新しいディッシュに非常に慎重に移します。

アッセイをランダム化するため、すべてのリングを同一のPBS含有プレートに入れます。大動脈の各セグメントは血管新生能がわずかに異なるため、リングは氷上で保持してください。次に、あらかじめ冷却したピペットチップを用いてアッセイプレートを準備します。

48ウェルプレートの各ウェルに、冷やしたBMEを約150 µLずつ加えます。滴下中にBMEはドーム状に固まります。BMEは物質の輸送や細胞の走化性を可能にし、さらに重要な点として、新生血管の形成につながる細胞分化と遊走を促進します。BMEの脱水を防ぐため、外周のウェルにはPBSを満たし、BMEのドロップを37 °Cで20〜30分間静置して凝固させます。BMEが凝固したら、ピンセットを用いてペトリ皿から大動脈リングを慎重に持ち上げます。損傷を防ぐため、リングはピンセットの先端間に形成される液滴の中に保持して移してください。液体の表面張力を利用して、各ドームの上部中央に大動脈リングを1つずつ配置し、37 °Cで10分間インキュベートします。各リングの上に、さらに150 µLのBMEを加え、20〜30分間インキュベートします。

37°Cにおいて、リングは現在BMEとアッセイ液に包まれています。アッセイを開始するために、プレートに材料を加えます。あらかじめ調製したヒト血管内皮細胞用無血清培地に、実験材料、またはポジティブコントロールとしての血管内皮細胞増殖サプリメント、あるいはネガティブコントロールを添加してください。

培地のみを使用します。各ウェルに500 µLの補充培地を加え、37 °Cで6〜12日間インキュベートします。このインキュベーション期間中、プレートを顕微鏡で観察し、大動脈から発芽する血管および、さらなる分岐血管によって特定される高度に成熟した血管を確認します。

リング組織から伸展している様子を、6日目から12日目の間に標準的な位相差実体顕微鏡下で三次元的に撮影します。加えて、6日目から12日目の間の様々な日に上清を回収し、1日以内に使用する場合は4°Cで保存し、後日使用する場合は-20°Cまたは-80°Cで保存します。回収した上清は、vgfに対するELISAや、一酸化窒素レベルを測定するGriessアッセイなど、さまざまな手法で分析することが可能です。

これらの画像は、リングをウェルに配置し、上段の画像に見られる培養液または培地、あるいは下段のパネルに見られる血管発芽のポジティブコントロールとして使用したECGSと共にインキュベーションした12日後に撮影したものである。各画像は、1条件あたり通常このアッセイで使用される12個のリングのうち、4つの代表的なスナップショットである。

個別のウェルに入っている各大動脈リングの角が黒くなっています。このように撮影すると、ECGSに曝露された大動脈リングでは血管の成長が見られ、矢印は形成された数多くの血管のうちのいくつかを指しています。個々の血管は、内皮細胞の連鎖として特徴付けられ、時折分岐が見られることは、それらが成熟していることを示しています。

培養液中に発芽血管は観察されません。上段の培地ウェルにおいて、大動脈コロナアッセイの実施手順を説明しました。この手順を行う際は、正確に操作し、条件を遵守することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。