生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

本手順の全体的な目的は、凝集させた細胞と細胞由来のマトリックスから、機能解析に使用可能な3D組織構築物を作製することです。これは、まずポリカーボネート製モールドを研磨して底面が丸い環状ウェルを作成し、次にポリジメチルシロキサン（PDMS）をそのポリカーボネート製モールドに鋳型として流し込んでテンプレートを作成することで達成されます。

次に、PDMSテンプレートを用いてarosウェルを形成します。最終ステップとして、arosウェルに細胞を播種し、細胞を凝集させて凝集性の組織リングを形成させます。最終的に、この手法は異なる細胞型を用いた細胞の自己組織化および組織工学の実現に利用でき、組織の構造と機能に対する細胞および細胞由来細胞外マトリックスの寄与の解析を可能にします。

この手法の他の組織工学アプローチに対する主な利点は、細胞とそれらが産生する細胞外マトリックスのみから、従来報告されていたよりも迅速に、かつ力学的解析に適した形式で組織構築物を生成できることです。まず、厚さ0.5インチのポリカーボネート片をフライス加工し、中心ポスト径2 mmの丸底環状ウェルを15個作成します。フライス加工によって生じたプラスチックの破片を取り除くためにポリカーボネート製モールドを洗浄し、乾燥させます。次に、PDMSをベースと硬化剤の比率10:1で混合します。溶液を脱気して気泡をすべて取り除いた後、ポリカーボネート製モールドに流し込みます。

次に、金型上の混合物を再度脱気して残っている気泡を取り除き、PDMSを60 °Cのオーブンで4時間硬化させます。PDMSの硬化待ちの間に、2% AROSをDMEMに溶解させます。硬化後、ポリカーボネートからゆっくりと剥がしてPDMSテンプレートを慎重に取り出し、PDMSを石鹸と水で洗浄し、DMEM AROS溶液とともにオートクレーブ滅菌します。オートクレーブ後のPDMSテンプレートを水平面に置き、まず各センターポスト成形部分にAROSをピペッティングし、次にその周囲の空間にAROSをピペッティングして、溶融AROSを満たします。

arosを約15分間放置して凝固させます。その後、型を反転させてPDMSからarosを切り離します。各ウェルの周囲の余分なarosを切り取り、12ウェルプレートの各ウェルにarosウェルを1つずつ配置します。

arosウェルの上部を覆わないように、ウェルの外周に細胞培養培地を加えます。次に、細胞の準備が整うまでプレートをインキュベーターに入れ、平衡化させます。ラット大動脈平滑筋細胞が90%コンフルエンスに達した時点でトリプシン処理し、再懸濁します。

細胞を5×10⁶ cells/mLの濃度で懸濁します。次に、平衡化したarosウェルに、再懸濁した細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。円を描くように動かしながら、各ウェルに細胞を塗布してください。

プレートをインキュベーターに入れ、24時間静置します。2日ごとに、ウェルの周囲から培地を吸引して除去し、aros moldが完全に浸るまで各ウェルに培地を補充して交換します。培養終了時に、小さなペトリ皿にPBSを満たしておきます。

各リングをセンターポストの上方にスライドさせて、arosモールドから取り出します。PBS Centerを入れたペトリ皿にリングを配置し、デジタルイメージングシステムの直下に置きます。エッジ検出ソフトウェアを使用して、リングの円周上の4か所（上、下、左、右）で厚さを測定します。

一軸引張試験を行います。リング状のサンプルを2本の細いワイヤグリップに取り付けます。リングに5 mNのティアロード（破断荷重）がかかるまで、グリップを伸長させます。

次に、厚さの測定値から算出した断面積を入力し、標点距離を記録します。リングをティアロード（破断荷重）と 50 kPa の間で8回プリサイクルさせます。8回目のプリサイクル後、10 mm/min の速度で負荷をかけ、10 mm/min で破断するまで牽引します。

各リングについて、最大引張応力と破断歪みを測定し、得られたデータから最大接線弾性係数を算出します。機能的なin vitro研究に加えて、これらの生細胞リングを融合させて組織管を形成することも可能です。外科用ハサミを使用してシリコンチューブの端を斜めに切り、ベベルエッジを作成した後、シリコンチューブをオートクレーブで滅菌します。

シャーレに培地を満たし、滅菌済みのカスタムシリコンチューブホルダーをバイオセーフティキャビネットに移動させ、空のシャーレの中に配置します。次に、arosウェルからリングを取り外し、培地を満たしたシャーレに入れます。使用前に湿らせるため、シリコンチューブを同じシャーレに入れます。

ピンセットを使用してシリコンチューブの先端をリングの中心に配置し、リングをシリコンチューブにゆっくりとスライドさせてはめ込みます。チューブに沿って両方向へ順次ゆっくりと押し込み、リング同士が接触するようにスライドさせます。リングの取り付けが完了したら、ポリカーボネート製ホルダー内でシリコンチューブの位置を合わせ、ホルダーの2つのパーツをネジで固定します。

ペトリ皿に55 millilitersの培地を加えます。組織チューブを除去するため、培養期間中は3日ごとに培地を交換してください。まず、ペトリ皿にPBSを満たします。

次に、ポリカーボネート製ホルダーからシリコンチューブを取り外し、ピンセットを使用して組織チューブをシリコンチューブからスライドさせ、ディッシュの中に入れます。正しく行われると、細胞はarosウェルの底に沈降し、設置後24時間以内に収縮して、Agarro sウェルの中心ポストの周囲に組織リングを形成します。これは、ラット平滑筋細胞から作製した2 mmの組織リングを用いて一軸引張試験を行い、得られた応力-ひずみ曲線の代表的なプロットです。得られた最大引張強度、最大引張弾性係数、および破断ひずみの値を用いて、異なる培養条件下で育成した組織リングサンプルの機械的特性を比較します。

組織リングの機械的特性は、細胞の播種数、培養期間、培養液、および使用する細胞種などの培養パラメータを変更することで制御できます。ラット平滑筋細胞に加えて、ヒト初代平滑筋細胞を用いても、同様の引張強度を持つ組織リングが形成されます。

ヒト間葉系幹細胞も凝集してリングを形成しますが、機械的試験に耐えうる十分な強度は得られませんでした。本システムでは、独自のarosウェルに細胞を播種するだけで、細胞のみから構成されるエンジニアリング組織構築物の作製が可能です。ポリカーボネート製の初期金型を一度加工すれば、それを用いてPDMSテンプレートを無制限に作製でき、さらにそのテンプレートから金型を作製できるため、追加の設備は必要ありません。

本システムは汎用性が高く、組織リングの作製に多くの異なる細胞種を用いてきたため、組織工学的応用だけでなく、組織の構造と機能に対する細胞および細胞外マトリックスの寄与に関するin vitro研究の両方に活用できる可能性があります。