幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

ショウジョウバエは、心臓の発達、機能、およびその基盤となるペースメーカー活性を研究する上で遺伝学的に非常に有用なモデル生物です。本手順書では、無傷および解剖した幼虫の調製方法と、心拍数のモニタリング方法について解説します。また、解剖した個体を用いることで、細胞外または細胞内電位の記録が可能となり、イオンチャネル機能の詳細な解析が行えます。

こんにちは。ケンタッキー大学生物学部の教員、ロビン・クーパーです。本日は、私の学生であるアン・クーパー、カイラ・ライマン、マット・ワード、そしてイースター・ボクが、Drosophila 幼虫の心拍数をモニタリングするための様々な手法をご紹介します。この後にお見せする拘束しない方法は、幼虫を単一の焦点面内で可視化させるため、「アントファーム法」と呼ばれています。

幼虫を最適に観察するために、1 cm × 0.5 cmの範囲において最高の空間分解能と倍率を得られるよう、2倍の対物レンズと0.5倍の接眼レンズを備えた解剖顕微鏡を使用してください。写真は接眼レンズに装着したカメラで撮影し、ビデオを記録することができます。本手法を開始するには、2枚のスライドガラスの間に、少量の餌とともに幼虫を挟み込みます。

スライドは、4辺すべてにプラスチック製スペーサーを配置し、1〜1.5 mmの間隔を空けて保持します。幼虫の頭部を下方に向けさせるため、標本を20〜45度の角度に数分間傾けます。心臓の拍動を観察するために、心臓または2本の気管のコントラストが最適になるよう顕微鏡のミラーを調整してください。

接着剤法は、ガラススライド上に幼虫を固定するための恒久的なマウント方法です。接着剤法を開始するには、まずきれいなカバーガラスをガラススライドの上に置きます。カバーガラスの端の隅に、シアノアクリレート系接着剤を少量滴下します。

次に、幼虫を水で洗浄します。過剰な餌を取り除くため、ティッシュやペーパータオルの角で液体を吸い取ります。幼虫を十分に洗浄したら、清潔なピンセットでそっとつまみ、顕微鏡下でカバーグラスから離れたスライドガラス上に、幼虫が腹側を下にするように配置します。

胃には、細かい黒い毛を伴うかすかな水平方向の溝があります。幼虫の背面を上に向けますが、そこには気管である2本の走行線（レーシングストライプ）が見えます。接着剤専用の2組目のピンセットを使用して、スライド端の液滴から少量を取り、反対側の角に配置します。

ピンセットの先端を覆うのに十分なごく少量の量を使用してください。動物を拾い上げ、腹側を黒い口の方に向けた状態で、固定されるように接着剤の上に配置します。

フックはカバーガラスの端またはその付近に配置してください。口部のフックと褐色の螺旋状の部分が接着剤に触れないようにします。幼虫を軽く押し下げて平らに広げてください。

試験物質を投与するには、シリンジを用いて幼虫の頭部の近くに小さな液滴を滴下するのが最適です。心拍数は、1分間に螺旋状の拍動が起こる回数を数えることで観察します。長時間の観察を行う場合は、その場で幼虫に餌を与え、脱水を防ぐために湿らせておきます。顕微鏡下で使用可能な解剖プレートを作成するには、磁気テープの一片の中央に、メスを用いて直径2 cmの穴を開け、それをガラススライドに貼り付けます。

ピン留めを容易にするため、曲げてペーパークリップに接着した解剖ピンを使用してください。解剖の際、無傷の3期幼生を解剖プレート上に置きます。背側を上にすると、クチクラを通して気管が見えるはずです。

口鉤の両側に2本のピンを、またらせんの両側にさらに2本のピンを刺して幼虫を固定します。次に、生理食塩水を加え、幼虫を湿らせた状態に保ちます。その後、coddle端で水平に切開し、続いてらせんの側面に沿って動物の頭部に向かって縦方向に切開します。

背面のピンを1本持ち上げ、クチクラの下に引っ掛けます。ピンを用いて広げ、体腔を開きます。

他の3本のピンでも同様に繰り返します。動物の体をピンで固定して開いた後、気管や心臓を傷つけないように注意しながら内臓を取り除きます。脳や一部の脂肪体などの構造は心臓に付着しており、これらを取り除く際に心臓を損傷させる可能性があります。

解剖後、調製物をHL three saline浴中で3〜5分間静置させます。薬理学的薬剤を心臓に直接投与しながら、この調製物を用いて細胞内記録および電場記録を行います。この解剖ステップの所要時間は合計で3〜6分です。電気的ペーシングを行うには、まずフォーカル電極を作成する必要があります。ガラス電極を加熱ヒーターの上で走らせて火炎研磨し、約45度の緩やかな曲げ加工を施してフォーカル電極を作成します。室温のHL three salineを満たしたフォーカル電極を、先端を下に向けた状態でマニピュレーターに装着します。

刺激電極のワイヤーが電極内の生理食塩水に接触していること、および刺激装置の電源がオフになっていることを確認してください。新しく心臓を解剖し、準備した試料を顕微鏡上に固定します。接地ワイヤーを生理食塩水に入れます。

ピンに触れたり、標本を乱したりしないよう注意してください。マニピュレーターを使用して電極を生理食塩水の中へ移動させる間、電極に焦点を合わせ続けます。生理食塩水に入れたら、電極の先端のルーメンを心臓に平らに密着させ、軽く触れるように配置します。

電極を配置したら、刺激装置の周波数を2 Hzに設定し、電圧を最低設定にします。刺激装置の電源を入れます。周波数を約3 Hzに調整し、心拍数が刺激装置のリズムに一致して速くなるまで、ゆっくりと電圧を上げてください。

これで、刺激装置を通じてリズムを操作できるようになります。さらに、化合物を添加し、それが収縮や電気伝導に影響を与えるかを確認できます。場電位記録を行うには、マクロパッチ記録電極に浸漬液を満たし、複合顕微鏡上のマニピュレーターに取り付けます。

電極をアンプおよび記録装置に接続します。マニピュレーターを使用して、顕微鏡に固定した解剖標本の心臓の上に電極のルーメンを降ろします。電極の先端で心臓に非常に軽く触れます。

心臓の別の領域から電位を記録するために、電位記録を行うことができます。電極の先端をゆっくりと持ち上げ、マニピュレーターを使用して新しい領域に移動させ、再び先端の電位記録を行います。心臓における電気信号の頻度と持続時間を精密にモニタリングすることで、幼生心筋細胞の膜電位を測定します。

まず、3 M 塩化カリウムを満たした鋭利な電極のルーメンが、垂直から約45度の角度で心臓に対して平らに接していることを確認します。適切に配置されたら、電極の先端で心臓にそっと触れ、先端を細胞内にタップして挿入します。電極が折れていなければ、再度使用することが可能です。

細胞内記録を用いることで、活動電位のイオン的根拠や電位の特徴的な波形を測定し、イオンチャネルの変異やチャネルモジュレーターの影響を検討することが可能です。以上で、心臓の記録方法、および細胞内電位とフィールド電位の測定方法について説明しました。これらの手法を用いて、心臓の変化だけでなく、薬理学的な操作や遺伝子改変による影響を解析することができます。

この手順を行う際は、心臓に付着している関連構造物を引っ張ったり、フォーカル電極で強く押しすぎたりしないことが重要です。また、接着剤を用いる方法では、開口部や球状部分を接着して塞がないように注意してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。