の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ

ここでは、成体心臓の解剖に向けて、Drosophilaの拍動する心臓を可視化するための2つの手法を提示します。まず、指示された線に沿って一度に切断し、頭部と胸部を除去します。次に、生殖器を除去し、ピンセットを用いて腹部の体腔を開きます。その後、腸管を取り除き、雌のハエの場合は卵巣を除去します。

幼虫の心臓を固定するため、腹部第3および第4節にある腹部脂肪体を慎重に吸引除去し、成虫の心臓を露出させます。バッファー溶液に入れた1匹の幼虫の頭部周辺に、まず histo acral glue を塗布して固定します。幼虫をゆっくりと伸展させ、さらに後端に、次いで幼虫の体壁の両側面に glue を塗布します。

こんにちは、GI Flerです。こんにちは、Karen erです。私たちはともにバーナム医学研究所の開発および老化プログラムのメンバーです。

本日は、幼虫および成体ショウジョウバエの拍動する心臓を可視化するために我々が開発した手順について解説します。これらの調製法を用いて、ショウジョウバエにおける心拍パラメータの可視化、観察、および定量化を行います。まず、準備として人工血リンパ溶液を調製します。

この溶液にはスクロース成分が含まれており、使用直前に冷蔵保存されたストック溶液から人工血リンパに添加する必要があります。細菌汚染を防ぐため、人工血リンパを室温に戻し、エアバブリングによって少なくとも15分間溶液に酸素を供給してください。次に、標準的なピペットプラーを用いて細いキャピラリーを数本作製します。これは、ハエの脂肪体を除去する際に必要となります。

すべての準備が整ったら、成虫のハエを麻酔します。これはFlyNapに2〜5分間短時間さらすことで行えますが、5分以上にわたってFlyNapに放置しないよう注意してください。また、短時間の冷却による麻酔も利用可能ですが、心拍数や活動性に長時間の影響を及ぼすため、二酸化炭素の使用は推奨されません。

次に、麻酔をかけたハエを、薄くペトロラタム（ワセリン）を塗布したペトリ皿に背面を下にして置きます。翅と体の疎水性クチクラがゼリーに可逆的に付着しますが、必要に応じてハエの位置を調整することができます。まず、曲がり鋏を用いて最初の切開を行います。

ハエの脚の下に鋏の刃を配置し、首に近い背面に向かって斜め下に向けます。一度切断すると、頭部の腹側神経索と脚が一度に除去されます。その後、スプリング鋏を用いて、標本を酸素供給された人工血リンパ液に浸します。

腹部第7および第8節で構成される腹部後端を、一回の切断で除去します。これにより、腹部の両縁に沿って側切を行うためのアクセスが確保され、後腸と腹部クチクラとの接続を切断することができます。鋏の刃を腹部先端の小さな開口部に挿入し、クチクラを側方に切断します。

これにより、腹側クチクラの片側の端が解放されます。ピンセットでフラップを掴み、腹部の反対側の外側端に沿って同様に切開します。これで、解放された腹側腹部クチクラのフラップを取り除くことができます。

腸およびその他の腹部器官は、通常、精密ピンセットを用いて優しく牽引することで、一塊として除去できます。内臓を除去すると、拍動する心管が現れます。心管は小さな空気筋によって背側のクチクラに付着しており、脂肪体で囲まれています。引き出された毛細管を、真空源に接続された1/16インチのプラスチックチューブに挿入します。

吸引力はチップの直径に比例するため、一度設定した後は直径40 µm以上のチップを備えたピペットを使用しないでください。この吸引システムは、心管周囲の過剰な脂肪を除去するために使用します。また、クチクラ周囲に蓄積した気泡やデブリの除去にも使用できます。

心臓自体に触れないよう細心の注意を払う必要があります。また、心臓の後部は非常に脆弱であるため、その領域も同様に避けてください。これで成虫のショウジョウバエの心管が露出しており、必要に応じて拍動していることが確認できるはずです。クチクラとそれに付着した心臓は、クチクラをワセリンからそっと持ち上げ、慎重に押し戻すことで位置を調整できます。

心臓組織に接触しないように注意してください。この時点で、標本を浸している溶液を新鮮な人工血リンパ液に交換します。操作を開始する前に、酸素供給を行いながら20〜30分間平衡化させてください。

調製物を60分以上にわたって維持する場合は、新鮮な人工血リンパで再灌流させる必要があります。これで本調製物は光学記録に使用できる状態となり、電気生理学的記録や組織学的操作にも利用可能です。幼虫内で拍動する心臓を可視化するには、別の手法が必要となります。

まず、処前の日にカバーガラスを準備します。爪楊枝を用いて、Sard溶液 50〜70 µLを 22 by 22 mmのカバーガラスに転写します。Sylgardを 65 °Cで一晩硬化させます。

次に、BrodyおよびBatesバッファーを調製します。調製後、分注して-20 °Cで保存し、必要に応じて解凍して使用できます。最後に、histo acral glueを塗布するために必要な器具を準備します。まず、細いキャピラリーを数本引き出します。

次に、直径約1/32インチの小さなプラスチックチューブを1.5 mLピペットチップに接続します。チューブの細い端にキャピラリーを挿入し、開口部の広い側が反対端に来るようにします。セットアップ後、キャピラリーを接着剤の一滴に浸し、プラスチックチップへの穏やかな吸引によって、キャピラリーに組織用接着剤を充填します。

接着剤を使用する際は、接着剤用キャピラリーの先端に付着した過剰な接着剤を取り除けるよう、予備のガラスキャピラリーをすぐに使える状態で用意しておく必要があります。接着剤は液体状ですが、緩衝生理食塩水に接触すると数秒以内に硬化します。ただし、通常はキャピラリーの先端から取り除いたり、試料に塗布したりするのに十分な時間、可塑性を維持します。

次に幼虫の固定を開始するため、Sylgardカバースリップの各コーナーの近くにHisto-acral glueを1滴ずつ配置します。接着剤の滴にB&Bバッファーを50 µL加えると、すぐに凝固します。接着箇所に囲まれた空間をB&Bバッファーで満たしてください。これにより、バッファーがスライド上に保持されます。

遊走期のL3幼虫を1匹取り、氷上の湿らせたティッシュペーパーの上に2分間置きます。これにより、幼虫の動きを鈍らせます。次に、幼虫をバッファーに移し、背側を上にするように向きを調整します。

こちらは同一の帯状構造を持たない幼虫の側面です。頭部領域とシルガードの間に、少量の接着剤を速やかに塗布します。接着剤は非常に速く硬化し、幼虫の頭部の動きを固定します。

ピンセットを用いて、動物の後端部分を注意深く掴み、緩やかに伸ばします。幼虫の後半部分の両側に接着剤を塗布し、この状態で固定します。体壁筋によるクチクルのさらなる動きを抑えるため、動物の側面にさらに接着剤を追加します。

これで幼虫はこの位置に固定されました。カバーガラスを人工血リンパまたはPBSを満たした小型ペトリ皿に入れることで、体壁の動きによる干渉を受けることなく心拍を記録できます。解剖後、新鮮で酸素を供給した人工血リンパ中で維持すれば、半温存状態の成体ショウジョウバエの心臓は数時間にわたって律動的に拍動し続けます。

代表的な例をここに、および補足動画1に示します。ここで示す羽化後3日の幼虫および羽化後1〜3週間の若いショウジョウバエの心臓は、一般的に1〜3 Hzの速度で規則的な鼓動を示します。一方、羽化後3週以上のハエは、一般的に不整脈傾向が強くなります。それにもかかわらず、これらの心臓は、酸素飽和させた人工血リンパ中で数時間にわたり自発的に鼓動し続けることが可能です。解剖手順の結果として損傷した成虫の心臓では、通常、極度に収縮して弛緩できず、しばしば制御不能に拍動する局所的な領域が見られます。羽化後3週未満のハエにおいて、1 Hzより遅い心拍数が観察されることは稀です。

その結果、そのような標本は損傷しているとみなされ、廃棄されます。以上で、光学イメージング用のショウジョウバエの幼虫および成虫の心臓の作製方法を実演しました。半心拍標本を作製する際は、心臓自体には決して触れないように注意してください。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。