の浸透圧の回避線虫（Caenorhabditis elegans）：二つの遺伝子のシナプス機能、ヒトのオルソログ NRXN1と NLGN1、

こんにちは、スペインのコルドバ大学遺伝学部のマヌエル・ルイス・ルビオです。私たちは、完全に解明されているC. elegansの神経系を利用し、自閉症の研究における実験ツールとしてC. elegansを用いています。私たちは、神経シナプスに関与し、自閉症との関連が指摘されている遺伝子に欠損を持つ線虫の変異体を研究しています。

Neurexinおよびneuroliginは、シナプスに存在する膜接着分子です。C. elegansの頭部には、浸透圧などのさまざまな刺激に対する応答を媒介する線虫の感覚器官であるamphidが存在します。amphidは、繊毛を持つ樹状突起を備えた12個の感覚双極ニューロンと、1つのシナプス前終末軸索で構成されています。

これらのニューロンのうち、ASHRおよびASHLと呼ばれる2つのニューロンは、浸透圧感覚機能において特に重要であり、高浸透圧の水溶性忌避物質を検知します。本ビデオでは、C. elegansのシナプス欠損変異体における浸透圧忌避行動を測定するための、4Mフルクトースリング法に基づいた手法を紹介します。

高浸透圧回避におけるneurexinおよびneuroliginの関与を評価するため、4Mフルクトース溶液を用いた手法により、nrx-1およびnlg-1遺伝子に欠損を持つC. elegans変異体の異なる反応を報告しました。実験当日に、1%コンゴレッドを含む4Mフルクトースストック溶液を調製し、室温で完全に溶解させます。NGMプレート上の固体培地の中心に、直径1cmの環状に塗布します。

15 µLの赤色4Mフルクトース溶液を使用します。フルクトースをアガロースに約5分間浸透させてください。この実験はブラインド法で実施する必要があります。試験される各系統を含むプレートは、別の実験者がラベル付けを行ってください。

SAは、これらの標識を用いて実施されます。実験の約24時間前に、各遺伝子型のL4幼虫をピックアップし、E. coli菌を含むNGMプレートに転移させ、翌日まで20 °Cで保持する必要があります。実験は若い成体を用いて開始してください。

各系統の個々の虫を静止円の中に入れ、それぞれの個体がticバリアに対して反応する時間を計測します。結論を得るためには、各系統につき10匹の個体を用い、最低3回の繰り返し実験を行う必要があります。赤色のリングを6回連続で回避した個体を正常と分類します。

6回未満の試行でリングから脱出した個体は、浸透圧感受性に欠損があるとみなされます。各SA Bristolのコントロール系統を使用し、リングの障壁を回避するため、2匹の個体をポジティブコントロールとして使用します。コントロール系統は、4Mフルクトースからなる浸透圧障壁に遭遇すると後退して反応します。神経欠損変異体は、浸透圧強度に関してこれらと同様の挙動を示します。

しかし、NEUR欠損変異体はこの浸透圧障壁を検知できませんでした。異なる活性ニューロンおよびノックアウトアレルを持つ二重変異体は、浸透圧に反応する野生型表現型を回復しました。RNA干渉摂食により虫をダウンさせるために、標的遺伝子に対応する断片を含むL 44 40ベクターで形質転換されたe coli HD 11五株の大腸菌コロニーを単離します。細菌はLBAまたは炭酸塩プレート上に単離し、翌日に回収します。

細菌のコロニーを1つ選び、LV液体培地に接種します。37°Cで振盪しながら約7時間培養します。この培養液を、カーボン封鎖およびIPTGを含むNGMプレートに滴下し、室温で一晩静置して細菌を増殖させ、標的遺伝子断片の発現誘導を開始させます。

RNA干渉には、陽性対照および非陽性対照を用いる必要があります。摂食実験において、陰性対照は同一です。

TL 44 40ベクターで形質転換したHT 115株を用いました。陽性対照として、22遺伝子配列を含むL 44 40ベクターで形質転換したELI HT 115細胞を使用しました。この遺伝子のノックダウンにより、ステレオ顕微鏡下で容易に識別可能なshaking表現型が生じます。

1日目。細菌を含むNGMプレート上のL4段階の個体を、細菌を含むプレートに移し、20 °Cで12時間培養します。これが絶食期間となります。

翌日、特定のRNA干渉標的遺伝子を発現する細菌を塗布したプレートに、fast young adult（若齢成虫）を移します。20 °Cで約48時間放置し、F1子代を得ます。その後、次の2日間にわたって、数匹のF1成虫を同じ細菌を塗布した別のプレートにピックアップします。

F2世代の子孫から若成体を抽出し、分離します。野生型Bristol N2系統を用い、細菌を含むNGMプレート上で表現型をスコアリングします。L4から成体期にかけて、個体が浸透圧障壁から後退することを確認してください。

C. elegansのnrx-1遺伝子の断片を発現する細菌を給餌したBristol N2野生型株は、4Mの溶液を検知できなくなりました。一方で、浸透圧障壁を検知できないnrx-1欠損変異体は、C. elegansのnrx-1遺伝子の断片を発現する細菌を給餌することで、この能力を回復しました。本ビデオでは、C. elegansにおける浸透圧回避反応に影響を与える遺伝子の効果を研究するための簡便な手法を紹介します。

コンゴレッドを用いたフルクトースの濃厚環を用いて、浸透圧強度に対する反応を分析します。neuroligin欠損変異体はこの反応に欠陥を示しますが、nrx mutantsは浸透圧ストレスの検出に障害はなく、野生型系統と同様の反応を示します。このビデオでは、nrx-1およびnlg-1遺伝子に異なるノックアウトアレルを持つ二重変異体系統が、浸透圧強度に反応する野生型表現型を回復することを示しています。

これらの観察結果は、RNA干渉のフィーディング法を用いて確認されました。この方法により、野生型系統にnlg-1遺伝子の対応する配列を発現する細菌を餌として与えると、浸透圧バリアの認識能が損なわれました。一方で、4Mフルクトース溶液を検出できないnrx-1欠損変異体は、nrx-1遺伝子の対応する配列を発現する細菌を餌として与えることで、この行動を回復しました。

この実験で示された結果は、nrx-1とnlg-1が線虫の感覚ニューロンのシナプス接続に関与している可能性があり、また、これらがシナプス機能に影響を与える形で相互に作用していることを示唆しています。それでは、皆様の実験の成功をお祈りしています。さようなら。