で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

この手順の全体的な目的は、数多くの表現型または代謝経路の根底にある遺伝子発現プロファイルを調査することです。まず、対照的な2種類の線虫系統からmRNAを単離することでこれを達成します。手順の第2段階では、SSI3またはSFIキャプチャー配列を含むcDNAを合成し、それらをマイクロアレイにハイブリダイズさせます。

手順の第3ステップでは、S SI 3およびSCIFIフルオロフォアを含むアンチキャプチャ配列を用いてマイクロアレイをハイブリダイズさせます。手順の最終ステップでは、マイクロアレイをスキャンし、magic toolソフトウェアなどのバイオインフォマティクスツールを用いてデータを解析します。最終的に、調査対象の生物学的現象を媒介する候補遺伝子が特定され、リアルタイムPCRなどの代替手法によって検証および定量化することが可能です。

一般に、この手法に不慣れな方は、スポットされたヌクレオチドが目に見えないため、23,000種類以上の固有的にプリントされたヌクレオチドの上に均質なハイブリダイゼーション混合液を重ね合わせることが難しく、苦労することになります。まず、同期化した健康な線虫からRNAを回収します。最初に、線虫を洗浄し、15 mLチューブ内で再懸濁してペレット化します。線虫のペレットを、0.1 M NaCl 7 mLと、氷冷した60% w/v ショ糖 7 mLの中に再懸濁します。

氷上で15分間インキュベートした後、再び線虫をペレット化します。これにより、細菌を除去した線虫が浮上してくるため、これを回収し、RNaseフリーの水で洗浄してペレット化します。再び、緩く凝集したきれいなペレットをマイクロ遠心チューブに移し、最大速度で30秒間遠心分離します。

吸引し、4°Cで10倍量のRNA laterに保存し、次工程まで待機させる。全RNAサンプルを調製するために、調製したペレットを最大速度で遠心分離し、上清を捨てて、少量の分子研磨用樹脂をペレットに加える。その後、液体窒素を用いて混合物を凍結させ、ペッスルで破砕する。

凍結させた線虫懸濁液を微粉末になるまで研磨し、研磨後も粉末を低温に保つために必要に応じて液体窒素を添加します。抽出物を5分間氷上に置きます。5分後、抽出物を700 µLのR-L-T-B-M-Eおよび合計472 µLの100% ethanolと混合します。

市販のキットを用いてRNAを抽出し、生物学的サンプルあたり最終容量60 µLの抽出RNAを得ます。次へ進む前に、DNase Iで処理してゲノムDNAの混入を除去し、その後、市販のRNAクリーンアップキットを使用してください。キットの手順に従い、最終容量を60 µLとして完了させます。

最後に、RNA濃度を測定し、マイクロアレイハイブリダイゼーションの前に、グリオキサール処理したサンプルローディング染料およびゲル解析を用いてRNAの完全性を評価します。従来の手法を用いて、精製したRNAを相補的DNAに逆転写させ、市販のキットを用いて分解されたテンプレートから精製し、60 µLの容量に調整します。超音波処理したサケ精子DNAでマイクロアレイスライドをブロッキングし、ハイブリダイゼーションを開始します。1時間後、ブロッキングしたスライドを二回蒸留水に浸し、スピンダウンさせます。

キムワイプを敷いた50 milliliterのコニカルチューブの中でスライドを乾燥させます。次に、2x フォルムアミドベースのハイブリダイゼーション緩衝液を調製します。まず、結晶を完全に溶解させるため、55 °Cで10分間加熱します。

その後、10,000 gsで1分間遠心分離します。次に、25 µLのCD NAと25 µLのハイブリダイゼーションバッファーを混合し、軽く弾いて混ぜ合わせます。混合液をクイックスピンし、80 °Cで10分間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドに触れないように注意しながら、CDNAサンプル全体をマイクロアレイスライド上にピペットで滴下します。サンプルをマイクロアレイスライド上に均一に広げるため、注射針を用いてカバーガラスをスライド上にゆっくりと下ろします。カバーガラスが完全に密着する前に一度持ち上げ、再び針でゆっくりと下ろして、カバーガラスが自然に定着するようにします。

この手法により、気泡の形成を最小限に抑えることができます。次に、スライドを50 mLのコニカルチューブに水平に配置し、50 µLの二回蒸留水を加え、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、スライドを洗浄した後、速やかに二度目のハイブリダイゼーションを行います。

SSCにおいて、光に敏感なキャプチャー試薬とAntifa試薬を含む2番目のバッファーを、同様の手法を用いて複数回適用し、その後、短時間のインキュベーション、さらに数回の洗浄、および乾燥を行います。その後、スライドをスキャンすることが可能です。画像は、オープンソースのmagic toolを備えたフリーソフトウェアを用いて解析できます。

「Project」タブ内で、簡潔に「Build Expression Profile」タブの下に新しいプロジェクトを作成して保存します。「Load Image Pair」を選択し、赤色画像ファイルを「Red」、緑色画像ファイルを「Green」として選択してください。次に、「Build Expression Profile」タブを選択します。「Load Gene List」を選択し、GCATウェブサイトから取得したC. elegansの遺伝子リストファイルをアップロードして、マイクロアレイ画像のアドレス指定とグリッド作成を行います。

「build expression profile」タブを選択し、「create edit grid」オプションを作成します。次に、グリッドを編集します。設定ダイアログボックスで、グリッド数を48に、各グリッドの行数を22行、列数を22列に設定し、スポットの番号付けを左から右、上から下の順に選択します。

コントラスト変化のパーセンテージを上げ、個々のスポットが容易に判別できるまでグリッドをズームインします。左側のパネルで左上のスポットを選択し、次に左上のスポットの中心をクリックし、続いて右上、そしてグリッド1の最下行のスポットを順にクリックしてグリッドを作成します。このグリッド作成の手順を、左から右、上から下へと、全48個のグリッドに対して繰り返します。

次に、「ファイル」タブを選択し、「現在のグリッドを保存」を選択して保存します。「完了」タブを選択し、解析に不要なスポットを除外します。「発現プロファイルの作成」タブを開き、「アドレス・グリッディング」オプションの下で「スポット・フラッギング」を選択します。

次に、ストリークスポットや背景蛍光にフラグを立て、「save current flags」を選択して保存します。「file」タブの下で、フラグが立てられたファイルをセグメント化する必要があります。最後に、「expression」タブの「explore」を選択し、特定の因子によって誘導または抑制された遺伝子を解析します。

「探索（exploring）」ダイアログボックスで、詳細な遺伝子マッチング基準を設定します。発現量の2倍以上の増加または減少の回数を指定します。強度をxとし、Xの値を発現変化の基準とします。

誘導遺伝子については最大値がXより大きく、抑制遺伝子については最小値がXより小さい場合にXとして入力します。本実験では、ダイスワップコントロール（dye swap control）を実施します。ステージ3およびステージ4の幼虫からそれぞれ独立して抽出した2つの全RNAを、「緑色：変異体 vs 赤色：野生型」および「赤色：変異体 vs 緑色：野生型」としてハイブリダイゼーションさせ、遺伝子発現の変化を確認します。同一の手順を用いて3つの独立した全RNA抽出を行い、市販のキットを用いてcDNAを合成します。各cDNAサンプルについて、3つのハウスキーピング遺伝子をコントロールとして用い、リアルタイムPCRをトリプリケート（n=3）で実施します。デモンストレーションとして、VSM1で誘導された遺伝子発現に関する以下の結果を確認します。

AK 1468変異体は、シナプス前終末が亢進した特徴を持つ線虫系統である。マイクロアレイ解析を行う前に、抽出したRNAの品質をゲル電気泳動を用いて確認する。RNase 1処理の前後に2つの無傷のリボソームサブユニットが存在することは、マイクロアレイに適した良好なRNAサンプルであることを示している。野生型のcDNAは赤色でラベルされ、VSM 1変異体のcDNAは緑色でラベルされる。1回のマイクロアレイあたりに解析される48個のグリッドのうちの1つにおいて、各小さな正方形はプリントされた単一のオリゴヌクレオチドを表しており、各アレイにおいてそれぞれ固有のオリゴヌクレオチドが配置されている。

第4段階の幼虫から単離した転写物のマイクロアレイ解析により、主要精子タンパク質（MSP）をコードする遺伝子がVSM1変異体で誘導されていることが示されました。また、第3段階の幼虫のマイクロアレイ解析においても、変異体において同一の遺伝子ファミリー内の発現変化が認められました。マイクロアレイによる予測をリアルタイムPCR解析で検証したところ、MMSP遺伝子ファミリーの一員であるMSP32がVSM1変異体で誘導されていることが明らかになりました。データは、同一のRNAサンプルを用いたリアルタイムPCRの3回反復試行の平均値を示しています。

このビデオを視聴することで、特に科学コミュニティで多くのオープンソースのバイオインフォマティクスソフトウェアが利用可能であることを踏まえ、ゲノムワイド解析のためのバイオインフォマティクスツールをどのように扱うかについて、十分な理解を得ることができます。