ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

pre-mRNA上のリボ核タンパク質の結合部位をマッピングするには、まず、対象となるpre-mRNAの指定領域を30ヌクレオチドのウィンドウでタイル状に配置し、タイル状のオリゴヌクレオチドをアレイ上に合成します。これらのオリゴヌクレオチドをアレイから熱脱離させ、標的とするRNPと共沈殿させます。開始時の全プールをSCI 3で標識し、結合したプールをSCI 5で標識して、両方を検出アレイに適用します。

その後、アレイをスキャンし、特徴抽出ソフトウェアを使用して結果を解析します。こんにちは。ブラウン大学MCB（分子細胞生物学）部門のWill Fairbrother研究室のKate Watkinsです。本日は、pre-mRNA上のRNAタンパク質複合体の正確な位置を決定するための、迅速で安価な手順をご紹介します。ラボでは、重複するオリゴヌクレオチドのプールとしてpre-mRNAを再合成します。

その後、このプールを共免疫沈降によって結合分画と非結合分画に分離し、マイクロアレイで解析することができます。この手法には多くの応用例がありますが、本研究では複数のスプライシング因子と、それらが選択的スプライシングに果たす役割を調べるために使用します。それでは、始めていきましょう。

本手順を開始するには、uc SC ゲノムブラウザを使用して、prem A プールを設計するための特定の遺伝子、スプライスジャンクション、またはその他の関心領域をダウンロードします。関心のあるウィンドウを選択し、リード長 30 nucleotide、オーバーラップ 20 nucleotide で計算上のタイリングを行い、各オリゴが前のオリゴから 10 nucleotides ずつシフトするようにします。30 nucleotide の長さのオリゴが定義されたら、それぞれの両端にユニバーサルプライマー配列を付加します。

カスタムオリゴヌクレオチドマイクロアレイへのプリントのため、オリゴをAgilent社に提出します。マイクロアレイが届いたら、アレイカバースライドをアレイハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、スライド上に500 µLの脱イオン水を静かにピペッティングして、表面からDNAオリゴの回収を開始します。各スライドのラベルが向き合うように、マイクロアレイスライドをカバースライドの上に裏返して置き、オリゴ回収プロセスを妨げる気泡が入らないように注意します。

ハイブリダイゼーションチャンバーを密閉し、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて99 °Cで一晩回転させます。翌日、チャンバーからアレイを慎重に取り出し、アレイ表面から遊離したオリゴを含む水を吸引します。回収したオリゴ溶液を1.5 mLのエッペンドルフチューブに入れ、50%の振幅で3〜5秒間のパルス超音波処理を3回行い、凝集塊を分散させます。次に、末端にTプロモーターを付加したユニバーサルプライマーを用い、低サイクルPCRでこのオリゴプールを増幅させます。

必要なサイクル数は、オリゴ回収の効率によって異なる場合があります。アクリルアミドゲル上でスミア状のバンドとして確認される過剰増幅を避けてください。最後に、Amon社のmega short script kitを用いてRNAに転写します。

RNAをフェノール・クロロホルム抽出して転写反応を停止させ、次に酢酸ナトリウムおよびキャリアとしてのglyco blueを用いたエタノール沈殿を行う。RNAペレットを105 µLのTEバッファーに再懸濁させる。これにより、RNA濃度を正確に決定する。

RiboGreenを用いて標準曲線を作成します。次に、蛍光プレートリーダーを用いて測定します。これで、プルダウンのための共免疫沈降を開始するためのRNAプールが準備できました。

まず、Protein AおよびProtein G DynaBeadsを1:1の比率で混合し、1反応あたり最終容量50 µLとなるように磁気ビーズを調製します。磁気分離スタンドを用いてビーズを1か所に集め、上澄み液を除去します。その後、冷えた1×PBSを用いて同量で2回洗浄し、2回目の洗浄後の状態にします。

ビーズを同量の冷たいための 1X PBS で再懸濁し、抗体 2 ng を添加します。この量は抗体によって異なる場合があるため、ビーズへの抗体の結合に最適な条件を見つけるには検討が必要な場合があります。混合物を回転台上にて 4 °C で一晩インキュベートします。

朝に、非特異的結合をブロックするために、超音波処理した酵母全RNAを1反応あたり2 µg加え、4 °Cでさらに30分間回転混和します。ブロッキングステップが完了したら、再度マグネットラックを使用して上清を除去します。次に、冷えた1x PBSでビーズを2回洗浄し、2回目の洗浄後のPBSをチューブ内に残した状態で、ビーズ混合液を50 µLずつ新しいチューブに分注します。

各co IP反応につき1本のチューブを用意します。これでビーズのco IP準備が整いました。次に、RNAオリゴプールと核細胞抽出液を混合し、マスターミックスを調製します。

RNPソースとして、マスターミックスから50 µL分注量を全サンプル保護用プライマーとして採取します。プライマー配列へのタンパク質結合や、RNAへの二次構造の導入を防ぐために、ユニバーサルプライマーのRNA版であるプライマーを添加することができます。共免疫沈降を開始するには、ビーズ分注量から上清を除去し、残りのマスターミックス120 µLでビーズを再懸濁します。反応液を4 °Cで1〜2時間ロッキングします。

インキュベーション終了後、ビーズを含む少量のEloquaを各co ipから取り出すことができます。結合効率や特異性の追加試験を行う場合は、残りの反応液をマグネットに置き、上清を除去してください。その後、冷えたone XPDSで1〜2回洗浄します。

RNPを介してビーズ上の抗体に結合したRNAがIPサンプルとなります。IPビーズを0.1 XTEバッファー中の1% SDS 50 µLに再懸濁し、サンプルを65 °Cで15分間加熱します。RNAを溶出させるため、以前にビーズに結合していたRNAを含む上清を除去し、フェノール・クロロホルム抽出で精製した後、エタノール沈殿を行います。その後、ペレットを0.1 XTバッファー 50 µLに再懸濁します。

次に、リバースユニバーサルプライマーを用いてサンプルの逆転写を行います。その後、ユニバーサルプライマーを用いてサンプルをPCR増幅させます。このうちの一方のプライマーには、T7プロモーターが含まれている必要があります。プールを増幅させるために必要なサイクル数は、co-IPの効率によって異なります。

Ambion社のmega shorts script kitを用いてサンプルを再度転写しますが、今回はキットに付属しているT7 UTPの代わりに、2 µLのamino allyl UTPを添加してください。このamino allyl UTPは、後ほどRNAをサイニンで標識するために使用します。転写が完了したら。

フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりサンプルを精製します。サンプルとアレイのハイブリダイゼーションを妨げる可能性があるため、glyco blueまたは酢酸アンモニウムは使用しないでください。ペレットを 4.5 µL の 0.1 M 炭酸ナトリウムに再懸濁します。

まずサンプルにラベルを付けるため、全サンプルに2.5 µLのヌクレアーゼフリー水を追加します。S3を3 µL添加し、さらにIPサンプルにはSCI 5を3 µL添加します。暗所で1時間インキュベートします。

室温で、各サンプルに4 MのヒドロキシルアミンHClを6 µL添加して反応を停止させ、十分に混合して遠心分離します。室温で15分間短時間インキュベートした後、フェニルクロロホルム抽出を行い、続いてエタノール沈殿により標識サンプルを精製します。色の大部分は遊離ヌクレオチドと共に有機相に抽出されるため、ペレットに目に見える色はついていない場合があります。

各ペレットを50 µLの0.1 XTEに懸濁します。Agilentアレイハイブリダイゼーションキットの手順に従ってマイクロアレイサンプルを調製しますが、以下の点のみ例外とします。RNAをフラグメント化しないでください。フラグメント化バッファーを添加した後、直ちにハイブリダイゼーションバッファーを添加してフラグメント化を停止させます。

サンプルをアレイ上に配置し、アレイを回転させながら50 °Cで3時間ハイブリダイゼーションを行います。50 mLコニカルチューブを用いて、以下の50 mL溶液を調製します。2×SCバッファーを1本、1×SCバッファーを2本、および脱イオン水を1本用意してください。

3時間のインキュベーション後、アレイスライドのサンドイッチ状の固定具を慎重に外し、2 X SSCバッファーに入れます。ピンセットを使用して、カバーガラスからアレイを静かに分離させます。

アレイに触れないように注意しながら、カバーガラスをゆっくりと取り除きます。スライドを引き抜いた後、コニカルチューブの蓋を閉め、60秒間ゆっくりと転倒混和させます。ピンセットを使用して、アレイを1X SSC溶液に移します。

チューブにキャップをし、1分間ゆっくりと転倒混和します。次に、アレイを2つ目のXSSC溶液に移し、再び1分間ゆっくりと転倒混和します。最後に、アレイを脱イオン水の入ったチューブに移し、30秒間ゆっくりと転倒混和します。

スライドの端をキムワイプに乗せて、アレイを乾燥させます。オリゴヌクレオチドが含まれている面を乱さないように注意しながら、ワイプの上でアレイを回転させ続けます。アレイを空のコニカルチューブに入れ、アレイのスキャンに進みます。

アレイのスキャンに進みます。以下は代表的なアレイです。各フィーチャーまたはオリゴは、非濃縮のトータルプールは緑色、IP濃縮プールは赤色で色付けされています。

各フィーチャーにおける信号は、そのチャネルの総強度で正規化されます。最終的な出力は、レッドチャネルとグリーンチャネルのログ比となります。アレイ上の各フィーチャーにおいて、各ゲノム座標における平均スコアが指定された位置にマッピングされます。

この平均化ステップの例として、スコアが2、4、および0.5である3つの重複した30 nucleotideオリゴヌクレオチドを示し、各10 nucleotideウィンドウの平均濃縮スコアを表示しています。ここでは、CLTA遺伝子におけるポリピリミジン結合タンパク質PTBの結合スキームの例を示しています。遺伝子の特徴は下部に記載されており、PTB結合領域の対数平均濃縮スコアは濃い赤色の垂直バーで表されています。薄い赤色のバーは、PTB結合の濃縮が見られない領域を示しています。

以上で、選択的スプライシングを受けるエクソンなど、関心領域全体をカバーするオリゴヌクレオチドプールを迅速かつ効率的に作成する方法を説明しました。私たちはマイクロアレイを用いてプールを解析していますが、Illumina法、Lexi sequencing法、あるいはより伝統的なサンガーシーケンシング法によって配列を決定することも可能です。この手順を行う際は、プールの作成において、RNAレベルまたはタンパク質レベルのいずれにおいても修飾が可能であることを覚えておくことが重要です。

RNAレベルでは、オリゴヌクレオチド配列に自己領域、疾患変異、多型、またはランダム変異を導入することが可能です。タンパク質レベルでは、RNA結合因子のリン酸化やその他の翻訳後修飾による修飾が可能です。また、結合環境を操作することで、目的のRNA結合タンパク質と競合または相互作用する追加因子のレベルを増減させることができます。

以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。