RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

このビデオの目的は、免疫沈降法を用いて細胞抽出物からリボ核タンパク質複合体のRNAおよびタンパク質成分を単離し、同定する方法を実演することです。こんにちは、私はミズーリ大学の分子微生物学・免疫学部でEli sso博士の下で研究している大学院生のGarrett Domです。ハイスループットシーケンシングの進歩と効率的なマイクロアレイ解析により、多くの研究および疾患モデルにおいて、包括的な遺伝子発現解析が容易かつ即座に利用可能なデータ収集手法となりました。

しかしながら、標的遺伝子のmRNAの定常状態レベルは、必ずしもタンパク質の定常状態レベルと直接的に相関するとは限りません。この両者の乖離は、RNA結合タンパク質の相互作用による転写後遺伝子制御で説明できると考えられます。

転写後調節は、標的mRNAとリボ核タンパク質複合体を形成することで、mRNAの局在、安定性、および翻訳に影響を与えます。細胞抽出物中のこの複合体から未知のde novo mRNA標的を特定することは、RNA結合タンパク質のメカニズムと機能、およびその結果としてタンパク質産出に及ぼす影響を理解する上で極めて重要です。本プロトコールでは、リボタンパク質免疫共沈降（RIP）と呼ばれる、リボ核タンパク質複合体に関連する特定のmRNAを特定するための手法について説明します。

実験を開始する前に、すべての試薬、容器、器具を揃えておくことが極めて重要です。ガラス器具は、Ambion社のRNA ZAPなどのRNase阻害剤で処理し、その後DEPC処理水で洗浄してRNaseフリーの状態にし、すべての試薬がRNaseフリーであることを確認してください。手順の最初のステップは、細胞溶解物からリボ核タンパク質複合体を回収することです。各サンプルに使用する総タンパク質を2～5 mg生産できるよう、対数増殖期の組織細胞を回収します。通常、150 mmの培養皿2枚で十分です。

ここでは、ヒト乳がん細胞株MB 231およびMC sevenを回収し、RNA結合タンパク質のリボ核酸相互作用を調査します。調査対象となる各RNA結合タンパク質について、標的mRNAとRNA結合タンパク質の適切な相互作用を最大化させるため、総細胞数とタンパク質量を最適化する必要があることに注意してください。4°Cで1000 RPMにて約8～10分間遠心分離して細胞をペレット化し、氷冷PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、チューブの底を軽く叩き、RNaseおよびプロテアーゼ阻害剤を含む調製済みのポリソーム溶解バッファーと同量で細胞ペレットを再懸濁します。

細胞ペレットの正確な容量を測定し、ピペットで緩やかに混合して細胞の凝集体を分散させた後、ライセートを氷上で5分間インキュベートすることを推奨します。13,000 Gで20分間、4 °Cで遠心分離してライセートからデブリを除去し、清澄化した上清を直ちに、あらかじめ冷却したRNaseフリーのマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保持して-80 °Cで保存してください。

このライセートは、-80 °Cで最大6ヶ月間保存可能です。タンパク質やmRNAの分解につながるため、凍結融解の繰り返しは避けてください。IPは直ちに行うことが最適です。

標準的なブラッドフォード法を用いて、タンパク質濃度およびライセートの定量分析を迅速に行います。次に、目的の特定タンパク質を単離するための材料を準備します。まず、タンパク質のプレスウェル（事前膨潤）を行います。

Spheroビーズを、5% BSAを添加したNT2バッファー中で一晩、4 °Cで保存します。PASビーズに対してNT2バッファーを4:1の比率で使用してください。4 °Cで最大数ヶ月間の長期保存が可能です。

使用前に0.1% sodium aziを添加し、最終的なビーズとバッファーの比率が1:1になるように、過剰なNT two bufferを除去します。1.5 mLのRNA freeマイクロ遠心チューブを用い、SRO speed slurryを100 µL取り出し、個々のIP反応につき30 µgの抗体を添加します。例えば、本実験ではマウスIgG1抗体であるwho are抗体を使用しています。

したがって、コントロール抗体としてもIgGを使用します。次に、抗体ビーズ混合液に100から200 µLのNT 2バッファーを添加します。さらに、バックグラウンドRNAに対する抗体コントロールとして、同種のアイソタイプ一致抗体または正常全血清を並行して使用する必要があります。

適切な抗体をビーズミックスに加え、4°Cでオーバーエンドミキサーを用いて一晩回転混合しながらインキュベートします。使用直前に、氷冷した1 mLのNT2バッファーで5回洗浄して抗体コートビーズを調製します。ビーズの洗浄は、4°Cで13,000 Gにて1〜2分間遠心分離して行います。上清をハンドピペッターまたはアスピレーターで慎重に除去します。

この洗浄により、抗体混合物から未結合の抗体およびRNA汚染物質を除去できます。最終洗浄が完了したら、ビーズを再懸濁し、氷冷したNT2バッファーを700 µL加えた後、標的mRNAを保護するために、RNase阻害剤（RNase OUT 10 µL、100 mM DTT 10 µL、EDTA 15 µLを含む）で処理します。NT2バッファーを用いて、全量を900 µLに調整します。

次に、標的複合体を免疫沈降させます。RIP手順後のRNA解析におけるバックグラウンドシグナルを低減させるため、プレクリアンスステップを行うことを強く推奨します。15 µgのアイソタイプコントロールを用いて、4 °Cで30分間プレクリアンスを行います。抗体でコーティングされていない、あらかじめスウェルさせたPASビーズを50 µL加えます。

4°Cで30分間、回転混和しながらインキュベートし、その後、遠心分離機を用いて4°C、10,000 Gで遠心分離します。ペレットを回収し、免疫沈降（ip）のために上清を保存してください。

次に、約2〜5 mgのタンパク質を含む、単離・精製済みの溶解液100 µLを、調製した抗体ミックスに加えます。溶解液を希釈することで、バックグラウンドを低減させることができます。チューブをラップで包み、密閉を確認して、4 °Cで4時間転倒混和しながらインキュベートします。その後、ビーズを4 °Cで5,000 G、5分間遠心分離してペレット化し、上清は前述の方法に従い-80 °Cで保存して、後の解析に備えます。ビーズを1 mLの氷冷したT2バッファーで5回洗浄し、遠心分離します。

次に、ハンドピペッターまたはアスピレーターを用いて上清を除去します。バックグラウンドを低減させるために、NT2バッファーにデオキシコール酸ナトリウム、尿素、またはSDSを添加した、より厳格な方法を用いる場合もあります。標的mRNAの分解を最小限に抑えるため、サンプルは可能な限り氷上に保持し、迅速に操作を行ってください。

最後に、DNaseおよびプロテイナゼK処理に続き、RNA沈殿を行うことで、リボ核タンパク質RNAを単離します。洗浄後、5 µLのRNase-free DNase Iを添加した100 µLのNNT2バッファーでビーズを再懸濁します。サンプルを37 °Cで5〜10分間保持します。1 mLのNNT2バッファーを加え、5,000 ×gで5分間遠心分離します。

上清を廃棄し、SROsペレットを100 µLのNT2バッファー、5 µLのProteinase K（10 mg/mL）、および1 µLの10% SDSで再懸濁する。再懸濁したビーズ混合物を55 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートし、10分ごとに軽くタッピングする。Proteinase Kはリボ核タンパク質成分の放出を促進する。ビーズを遠心分離してペレットにする。

室温で5,000 Gで5分間遠心分離し、約100 µLの上清を回収します。次に、ビーズに200 µLのNT2バッファーを加え、5,000 Gで2分間遠心分離します。約200 µLの上清を回収し、ビーズは廃棄します。

上清を合わせ、300 µLの下層用酸性フェノールを加えてボルテックスします。室温で1分間撹拌した後、室温で最大速度で1分間遠心分離します。上層を250 µL回収します。

界面を乱すと汚染の原因となるため、細心の注意を払ってください。RNAサンプルに、pH 5.2の酢酸ナトリウム25 µL、冷却した100%エタノール625 µL、およびGlycoBlue Mix 5 µLを加えてください。その後、-20 °Cで一晩保存します。

さらに、RNAを適切に回収するために、GlycoBlueを添加します。GlycoBlueはキャリア分子として機能し、翌日のRNAペレットの視認性を向上させます。チューブを3〜5回反転させて混ぜ合わせた後、4 °Cで12,000 Gにて30分間遠心分離し、上清を捨てます。青色のペレットに、あらかじめ冷却した70%エタノールを1 mL加え、反転混和またはボルテックスミキサーで混ぜてから遠心分離します。

4 °Cで12,000 Gにて2分間遠心分離します。上清を捨て、4 °Cで12,000 Gにて1分間さらに遠心分離します。残った70% ethanolをピペットで取り除き、ペレットを風乾させます。

室温で5分間静置します。20〜40 µLのRNaseおよびDNaseフリー水で再懸濁します。これで、NanoDrop分光光度計による定量、および定量リアルタイムPCRやマイクロアレイ解析などの後続アプリケーションにサンプルを使用できるようになります。RNA抽出後、マイクロアレイおよび定量リアルタイムPCRを行い、RNA結合タンパク質WHOのmRNA標的および免疫沈降による濃縮度を明らかにしました。

ウェスタンブロットによる確認で、リボヌクレオプロテインのクリーンな単離が明らかになりました。定量PCRでは、IgGコントロールと比較して、標的mRNAであるbeta actinの濃縮倍率が示されています。マイクロアレイ解析により、乳がん細胞株であるMCF7とMDA-MB-231の間で固有の遺伝子プロファイルが明らかになりましたが、全体として、リボヌクレオプロテイン免疫沈降法は、RNA結合タンパク質とそのmRNA標的との相互作用を単離し研究するための優れたツールであることが、当グループおよび他の多くの研究グループによって確立されています。本手法はその性質上および実践において繊細ですが、正しく実行することで、最近まで発見や解析が困難であったこれらのリボヌクレオプロテイン複合体を単離することが可能になります。