マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

本プレゼンテーションでは、インスリン分泌刺激剤に応答した膵島における動的なインスリン分泌、カルシウム流入、およびミトコンドリア電位変化を同時に測定するための、マイクロ流体ベースの膵島灌流システムを紹介します。この灌流システムは、3層構造のマイクロ流体デバイス、シリンジポンプ、および分画回収装置で構成されています。分泌刺激剤によって誘導されたカルシウム流入とミトコンドリア電位は、蛍光顕微鏡セットアップを用いてイメージングされます。

こんにちは、イリノイ大学シカゴ校移植外科、Val Holter博士の研究室のOla Wallerです。こんにちは、同じくHolter研究室のDon Leeです。こんにちは、同じくHolter博士の研究室のTricia Hartです。

本日は、線形グルコース勾配を用いた眼瞼の同時イメージングの手順について解説します。当研究室では、眼瞼の視覚的特徴と機能を研究するためにこの手法を用いてきました。それでは始めていきましょう。

本手順で使用するマイクロ流体デバイスは、標準的なフォトリソグラフィーによって作製された、硬化済みPDMSの3層から構成されています。シリコンマスターから作製される第1層には、アイレットを緩やかに保持するためのマイクロ流体デバイスのウェルがあり、その深さは150 µm、直径は500 µmです。第2層には、高さ500 µm、幅2 mmのチャネルがあります。

溶液の交換効率を高めるため、チャネルの中央部を拡張して流れを分散させています。デバイス内部では、層の中央に高さ3 mm、幅7 mmの穴を開けることで交換ウェルを形成します。第3層は厚いPDMSスラブです。この層を準備するには、チャネルの入口および出口に合わせるように、両側に小さな穴を開けます。

3つの層がすべて作製された後、まず第1層をウェルが上を向くようにしてガラススライドに接合します。次に、チャネルの間隔が上を向くようにして、第2層を第1層に接合します。最後に、第3層を第2層に接合します。

各層の接合が完了すると、デバイスは実験に使用可能な状態になります。70% ethanolを満たし、Tygonチューブでデバイスの入口ポートに接続した10 milliliterシリンジを用いて、ethanolをデバイスチャネル内に流し、マイクロ流体デバイスを滅菌します。その後、同じ構成で脱イオン水を流し、ethanolを洗い流します。

デバイスの滅菌後、タイゴンチューブを用いて加熱顕微鏡ステージ上に配置し、高グルコース溶液および低グルコース溶液を満たしたシリンジポンプをY字コネクタに接続します。次に、これをマイクロ流体デバイスの入口に接続します。マイクロ流体デバイスの出口は、分画回収装置に接続します。

チューブが37 °Cのホットプレートの上に置かれていることを確認してください。実験を通じて溶液を生理的温度に維持することが非常に重要です。次に、LabVIEWプログラムを使用して、実験中にマイクロ流路ネットワークに灌流させるグルコース濃度勾配を開始します。

このソフトウェアは、2種類のグルコース溶液の流速を変化させます。シリンジポンプを制御することで、線形、ベル型、およびスクエア型のさまざまなグルコース濃度勾配プロファイルを作成できます。本実験では、計算された期待値との比較を示しており、2 mMから25 mMの線形勾配を用います。この際、2種類のグルコース溶液の流速を0.01 mL/minずつ変化させ、溶液混合後にデバイスへ流入する流速を0.25 mL/minの一定値に設定します。

適切なグラジエントプロファイルを選択したら、グラジエントの安定性をテストします。まず、グラジエントシステムを開始します。次に、分画コレクターを開始し、1 mLのエッペンドルフチューブに分画を回収します。

次に、血糖測定器を使用して、各チューブ内のグルコース濃度を測定し、excelで記録します。血糖測定器から得られた結果を分析してください。続いて、高グルコース溶液が入ったシリンジを、Krebs ringer緩衝液で調製した0.5%BSA溶液を含むシリンジに交換し、1 mL/minの速度で50 mLをデバイスに灌流させます。

これにより、インスリンがマイクロチャネル壁に非特異的に吸着するのを防ぎ、BSAによる灌流後の分泌インスリンレベルを測定する際の正確性を確保します。これを高グルコース溶液で置換します。厳選した25～30個のマウス膵島を、カルシウム指示薬であるfura-2 AMおよびミトコンドリア膜電位指示薬であるrhodamine 123を含む2 mMグルコースKrebs-Ringer緩衝液に懸濁し、37 °Cで30分間インキュベートします。

インキュベーション後、デバイスを灌流システムから切り離し、アイレットを含むピペットのチップをインレットポートに挿入して、慎重にマイクロ流体デバイスにロードします。アイレットを分注した後、デバイスを灌流システムに再接続してください。その際、気泡が入らないよう注意してください。次に、シリンジポンプを作動させ、2 mMのグルコースを含むKRBでアイレットの灌流を開始します。

このステップでは、培地から過剰な染料を洗浄し、実験で使用する励起および蛍光フィルターセットと露光時間を指定します。次に、低グルコース溶液を用いてアイレットを処理しながら、分画コレクターを1分間隔で回収するように設定します。シンプルなPCIイメージングソフトウェアの関心領域（ROI）ツールを使用して、撮像したい領域またはアイレットを定義します。

また、細胞を10分間洗浄した後、減算するバックグラウンド領域を囲み、グルコース濃度勾配分画コレクターを作動させ、タイムラプスイメージングを開始します。30分後、ソフトウェアと高濃度グルコースシリンジポンプの電源を切ります。その後、高濃度グルコースの影響を洗い流すため、低濃度グルコースによる灌流を継続します。

10分後、シリンジポンプの電源を切って低グルコースのフローを停止させます。灌流後、解析のためにデータをExcelにエクスポートします。灌流液中に分泌されたインスリン量は、マウス膵島用ELISAで測定できます。

ここに示すように、2から25 millimolarのグルコースの線形勾配で灌流を行いました。カルシウム流入とインスリン分泌は、6 millimolarのグルコースに相当する灌流開始後約13分で誘発されます。ミトコンドリア電位の変化は、予想通り、より早い約11分で観察されます。

このデータは、眼点（eyelet）の生理学的特性を評価する上で、このマイクロ流体ネットワークを使用することの利点を示しています。ここまで、眼点の生理学研究にマイクロ流体パラフュージョンデバイスを使用する方法について説明しました。この手順を行う際は、デバイス内に気泡がないことを確認することが重要です。気泡があると、実験中に眼点が移動する可能性があるためです。

また、アイレットを乱すことなく、流量を1 ml/minまで調整することが可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。