マイクロ流体ネットワークを用いた脳スライスの刺激と標準灌流チャンバー

本日ご紹介するプロジェクトの主な目的は、脳 slice 刺激を空間的および時間的に制御できるようにすることです。もう一つの重要な点は、すでに複雑となっている電気生理学的なセットアップに簡単な変更を加えることで、実際にこの脳 slice 刺激を利用している様々な研究室に、このマイクロ流体デバイスを普及させることができるということです。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校バイオエンジニアリング学科のエディントン研究室の Java Chek Mohammad です。

本日は、脳切片刺激用の単純な微細加工マイクロ流体デバイスの適用方法について解説します。本日ご紹介する脳切片デバイスは、いくつかの理由から非常に有用であり、その主な理由は、極めてモジュール性が高く、新たな改造を加えることなく既存の電気生理学的セットアップに組み込める点にあります。また、多くのマイクロ流体デバイスを複雑にする要因となるチューブやポンプの使用を回避できる点も特徴です。

また、パッシブポンプ法を用いているため、チューブやポンプは一切不要です。3点目は、標準的な電気生理学のセットアップで使用される、カバーガラスと標準的な灌流チャンバーの間に挟み込む薄いPDMSメンブレンシートであるということです。本日実演する手順は、標準的なSU-8リソグラフィプロセスを用いて作製されたSU-8マスターから始まります。

本日使用するマスターは2レベル構造となっており、1つのレベルにはマイクロチャネルの設計が、もう1つのレベルにはこれらのチャネルの上部に配置されるビア開口部の設計が含まれています。これにより、チャネル内を流れる溶液がビア開口部から外に出ることができます。このマスターはシリコンウェハー上に作成されており、このデバイスの上にシリコンまたはPDMSを流し込み、ウェハー上の構造をPDMSに転写して成形します。それでは、このデバイスの上にPDMSを流し込みます。

次に、硬化後に形成され、カバースリップに接合されたPDMSメンブレンを取り出します。これでマイクロ流体デバイスが完成します。続いて、灌流チャンバーの底面に薄いPDMS層をコーティングし、標準的な灌流チャンバーを改造します。

この改造した灌流チャンバーが用意できたら、先に作製したマイクロ流体デバイスを灌流チャンバーに接合します。マイクロ流体デバイスの作製において、重要な点が2つあります。1つ目は、PDMSを注ぐ前にホットプレートの電源を切っておくことです。これにより、ウェハー上にPDMSを注いだ際に、即座に硬化することを防げます。

もう一つの重要な点は、シリコンウェハの四隅に使用するスペーサーの高さが、シリコンウェハ上の最も高い構造物よりも低くなければならないことです。これは、PDMSの硬化工程において、VR開口部を確実に形成するためです。現在、私たちはソフトウォール式のモジュールクリーンルームにおり、こちらが標準的なC8リソグラフィープロセスを用いて作製したマスターです。

これは2層構造のマスターであり、第1層には4つの入口と1つの出口を持つチャネルのデザインが施されています。また、4つのすべてのチャネルの中央領域には、チャネルの上に配置されたビアまたはポストが存在します。これらは作製プロセス中に作成されたアライメントマークです。

次に、取り外し方法とPDMSのキュアリングについて説明します。エッジビード効果により、ウェハの外周部の厚さは、中央部の実際のデバイスよりも厚くなります。そのため、まずはレイザーブレードを使用してこれらのアライメントマークを除去します。その後、ウェハを固定するために、高さ140 micronのスペーサーをウェハの四隅に配置します。

カミソリの刃が実際のデバイスに近づかないように注意してください。次に、エアダスターを使用してこれらのSVA粒子を除去します。これでウェハはPDMSモールドの作製準備が整いました。ただし、その前に、高さ140 micronのスペーサーを配置する必要があります。

ウェハーの四隅に4枚のテープを貼ります。次に、テープがウェハーに適切に密着しているかを確認します。140 µmの高さのテープを使用した理由は、チャネルとVSを持つ2層マスターの高さが150 µmであるためです。

PDMSの硬化中に上から重りを載せますが、これはPDMSシートを平坦に仕上げるためです。そのため、四隅に等しい高さのスペーサーを4つ配置しています。それでは、デバイス作製のためのPDMSのコーティングと硬化の手順について説明します。

その前に、PDMS溶液の調製方法を説明します。まず、ベース10部に対して硬化剤1部を加え、十分に混合します。この混合過程により、PDMS溶液中に多くの気泡が生じます。これらの気泡を除去するため、PDMSをデシケーターに入れます。デシケーターに10分間置くことで、気泡がなくなります。

これでPDMSが硬化準備に整いました。次に、ウェハー上にPDMSを塗布し、硬化させてPDMSメンブレンを得る方法を説明します。ウェハーにPDMSを載せ、この透明フィルムでPDMSを覆います。

これにより、デバイスの支持体を外してデバイスを透明フィルムから分離させることができます。次に、透明フィルムの上に重りを置きます。重りを使用する理由は、PDMSの厚さを均一にするためです。また、もう一つの重要な目的は、ビア開口部を得ることにあります。

したがって、v（ベント）がある箇所にはPDMSが存在しないようにする必要がありますが、ウェイトを使用することでこれを実現できます。ここでご覧のように、ホットプレートの電源は切られています。その理由は、PDMSが即座に硬化するのを防ぐためです。そして、PDMSを注ぐ前に、ウェハーが水平であることを確認してください。

次に、先に準備したPDMSを移します。気泡が発生しないよう、ウェハーの十分に近くからPDMSを分注してください。ここで最も重要な点は、PDMSの上に透明フィルムを載せる方法です。

シートを配置する際に、気泡が発生しないように注意してください。ここで、ガラススラブを1枚配置し、余分なPDMSを排除します。さらに3枚のガラススラブを配置し、このマスターにおいてガラススラブが動かないように固定します。

これらの特定の形状において、4枚のガラス板を配置することで、透明なプレートとウェハーの間に過剰なPDMSを逃がすことができることが分かりました。1〜2分間待機した後、ホットプレートでの処理を開始します。使用するマスターや設計によって、ビア開口部を適切に形成させるために、ガラス板の枚数を増減させる必要がある場合があります。ここでホットプレートをオンにし、温度を75°Cに設定します。

温度が75°Cに達したら、タイマーを1時間に設定し、PDMSを硬化させます。PDMSを1時間硬化させた後、ホットプレートの電源を切り、50°Cまで温度を下げます。これは、SEAにひび割れが生じるのを防ぐためです。

75℃から室温へすぐに移動させます。ここでホットプレートの電源を切り、50℃まで温度が下がるまで待ちます。ホットプレートの温度が50℃まで下がったら、透明フィルムからウェイトを取り除きます。次に、ホットプレートからウェハーを取り出せば、切断準備が完了です。

これでPDMSシートをC8マスターから取り出す準備が整いました。まず、アルミホイルを取り除きます。次に、透明シートを取り除きます。これで標準的な灌流チャンバーが完成しました。

位置合わせができるように、マイクロ流体デバイスの穴、および入口ポートと出口ポートを修正しました。これらが、PDMSメンブレン上の4つの入口ポートと1つの出口ポートです。

これらは、灌流チャンバーにある4つの入口と1つの出口と一致している必要があります。次に、灌流チャンバーをスライドさせ、PDMSメンブレンの穴に合わせて調整します。位置が揃ったので、カットする準備が整いました。

ここで、プローブを使用してチャンバーを取り出します。PDMSメンブレンのすべての端が剥離可能な状態であることを確認してください。その後、フリーザーを用いてPDMSメンブレンを取り除きます。デバイス上部からPDMSを取り除く際は、PDMSメンブレンを破らないよう、非常にゆっくりと動かしてください。

次に、SC 8マスターで形成されたキャビティを持つPDMSメンブレンを上に配置し、平らにすることを確認します。このように行う理由は、インレットおよびアウトレットポートの穴を開ける際に、カバースリップと接合されるPDMSの側面が粗くならないようにするためです。

したがって、キャビティが上面にあることを確認する必要があります。次に、穴を明確に視認できるようにするため、入口ポートと出口ポートを作成します。背景に黒色を配置します。

次に、入口ポートと出口ポートを作成します。ポート部分にPDMSが残っていないことを確認してください。そのため、PDMSを除去します。これで、PDMSメンブレンを別の透明シートに転写します。

シートとカバースリップをプラズマ処理し、再びキャビティが上を向くように設置します。この表面とカバースリップの両方がプラズマ処理されると、これら2つの表面を接合させてマイクロ流体ネットワークを形成し、PDMSシート間の気泡を除去することができます。また、透明度を確認するためにスコッチテープを使用できます。

これにより、PDMSシートが平坦になり、ボンディングがより確実に進行します。次に、再びスコッチテープを上面に使用し、PDMSメンブレンからほこりを取り除きます。これで、PDMSメンブレンとボンディングさせるカバーガラスを配置できます。

これで、2つのPDMSとガラスのプラズマ処理準備が整いました。このマイクロ波改良型プラズマシステムを使用して、PDMSとカバーガラスにプラズマ処理を行います。このシステムでは、ガラスチャンバーによってマイクロ波内部でプラズマを生成できます。サンプルを内部に配置し、チャンバー内を真空にします。

これで酸素を流すことができます。プラズマシステムの準備が整いました。プラズマを可視化するため、この特定のシステムでは出力10%、時間は10秒に設定します。プラズマ処理を行っている間に、出力を100%まで上げ、照明を消しました。

プラズマ処理直後のプラズマを確認できます。プラズマ処理による親水性の低下を防ぐため、カバースリップとPDMSの両方の表面をすぐに接合させる必要があります。カバースリップを配置したら、気泡が入らずに表面全体が接合されていることを確認してください。

気泡がある場合は、取り除いてください。そのまま5分間放置し、接着させます。これで、底面をPDMSで修飾した灌流チャンバーが完成しました。

これは事前に行っておいた操作です。電源を切ったホットプレートの上に透過フィルムを配置しました。その後、先ほど示した方法と同様に調製したPDMSを流し込みました。

次に、PDMSの上に灌流チャンバーを配置し、ここに示すように単一の重りを載せて、75 °Cで30分間キュアさせました。さて、PDMSとカバーガラスの接合が行われるのを待っている間に、チャンバーの準備を進める方法をご説明します。これにより、チャンバーとマイクロ流体デバイスを接合させることができます。

したがって、不要な部分から過剰なPDMSを除去する必要があります。まず透明フィルムを取り除き、次にPDMSを除去します。続いて、入口および出口ポートからPDMSを除去します。これで、先に準備したマイクロ流体デバイスと接合させる準備が整いました。

5分間待機したので、マイクロ流体デバイスを透明フィルムから剥がす準備が整いました。ただし、PDMSとカバーガラスが剥離しないよう、ゆっくりとした速度で透明フィルムを剥がす必要があります。灌流チャンバーの準備ができたので、PDMSをコーティングしたばかりのチャンバー底面と、PDMSが付着しているマイクロ流体デバイスの上面にプラズマ処理を行います。

それでは、これら2つのパーツを両方ともプラズマチャンバーに入れ、10%の出力で10秒間プラズマ処理を行います。これで両方の表面にプラズマ処理が施され、接合可能な状態になりました。接合する前に、チャンバーの入口ポートと出口ポートがマイクロ流体デバイスと一致していることを確認する必要があります。

合わせるべき特徴点は十分に大きいため、特別な装置は不要であり、目視で合わせることが可能です。チャンバーの上に配置して位置を合わせた後、すべての表面が密着していることを確認し、5分間そのままにしてください。5分間待機させることで、実験に十分なボンディング（接合）が得られます。

マイクロ流体デバイスとチャンバーの接合が完了しましたので、次にチャネル表面を親水化します。これにより、A CFS溶液やその他の神経伝達物質を実際に流す際に、溶液がよりスムーズに流れるようになります。デバイス全体をプラズマ処理装置に入れ、10%の出力で1分間プラズマ処理を行い、内部チャネル表面全体を親水性にします。

次に、これを水で満たし、実際の実験を行うために電気生理学のセットアップへと移動します。それでは、電気生理学のセットアップへ移動し、このデバイスを脳切片に使用する準備が整いました。こんにちは、私はuoです。

私はイリノイ大学バイオエンジニアリング学科のArrington博士およびFall博士と共に研究を行っています。これから、こちらのプラットフォーム上に設置したマイクロ流体デバイスを用いて作業を行います。片側には、灌流チューブが見えます。

反対側には吸引チューブが見えます。このデバイスには、95%の酸素と5%のCO2をバブリングしたCSF溶液を灌流させます。micro Vデバイスの準備が整いましたので、脳スライスを取り出し、microデバイスの上に配置します。

次に、脳切片を円形の開口部の上に載せ、アンカーを用いて脳切片を固定します。脳切片が固定されたので、神経伝達物質を用いて刺激を行います。ここに4つの入口がありますので、これら4つの入口から出口に至る受動ポンプを利用して、各入口に神経伝達物質を導入します。

それでは、Fall博士にこの装置についてお話しいただきます。私たちにとって何が重要なのでしょうか。こんにちは、私はChris Fallです。脳生理学の研究をしています。

脳切片を使用する理由は、マイクロ電極やイメージング技術によるアプローチを可能にするためです。これまで、これらの脳切片における神経伝達物質の環境を変化させる唯一の方法は、切片全体への灌流を変更するか、非常に小さなマイクロピペットを用いて神経伝達物質を直接パフ（局所投与）することだけでした。そのため、エディントン教授のグループと一緒に研究できることを非常に嬉しく思っています。

この新技術により、脳の広範囲にアプローチし、神経伝達物質の環境を局所的に変化させることが可能になります。そして、電極やイメージング技術を同時に導入することができ、将来的には多電極記録デバイスを同一ユニット内に組み込むこともできるでしょう。さて、こちらにマイクロ流体デバイス内のマウス脳スライスが見えます。

脳が多くの異なる領域で構成されていることは、目視でも確認できます。これらの領域はそれぞれ異なる機能を担っています。そして、生存している動物の体内では、脳のこれらの異なる領域において、神経修飾物質や神経伝達物質のトーンが異なっているはずです。

そして、電気生理学的記録やイメージング記録を行っている際に、この手法をスライスチャンバー内で再現したいと考えています。そのため、異なる神経伝達物質を、異なる濃度および異なる時間経過で、これらの異なる領域に投与できることは非常に有用です。神経伝達物質を直接可視化することはできませんが、ここでは例として、脳スライスの異なる領域に注入されている蛍光色素を示します。

ここでは、デバイスのチャネルに蛍光染料を流し、作製した細孔から染料が出てくる様子を可視化した動画をご覧いただけます。この初期のプロトタイプにおいても、流れの空間分解能がいかに精密であるかが分かります。動画の中で、染料がチャネルに流れ込み、その後穴から流出する様子を確認でき、さらにその染料を洗い流すことで、流れの時間分解能についてのご理解を深めていただけます。

本日はご視聴いただきありがとうございました。マイクロフルイディクス、そしてマイクロマシンを従来の生理学的手法と融合させることで、脳の仕組みの解明にどのように寄与できるかを示すことができたと思います。ありがとうございました。