可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

本手順では、蛍光標識したRNA転写物をXenopus oocytesに注入し、その局在をモニタリングします。まず、RNAを蛍光ヌクレオチドで標識します。

in vitro転写反応の後、RNAをマイクロインジェクション装置にロードします。卵母細胞をインジェクションディッシュに配置し、慎重にマイクロインジェクションを行います。最後に、共焦点顕微鏡でイメージングを行う前に、RNAの局在化が起こるように卵母細胞を培養します。

こんにちは。ブラウン大学分子生物学・細胞生物学・生化学科のKimberly Mallory博士の研究室に所属しているJames Gagnanです。本日は、Xenopus卵母細胞におけるサブセルラーなRNA局在を可視化する手順について解説します。私たちの研究室では、脊椎動物の初期発生過程におけるRNA局在に必要なRNA構造およびタンパク質因子の研究にこの手法を用いています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、付属の書面プロトコルに記載されている通り、放射性および蛍光の両方で標識されたmRNAを転写します。テンプレートDNAを分解するためにDNaseを加え、次にEDTAを加えて反応を停止させます。

G 50カラムを用いてスピンし、未反応のヌクレオチドおよびその他の低分子を除去します。次に、エタノール沈殿によってRNAを濃縮し、洗浄して再懸濁します。シンチレーション計数法で濃度を測定した後、RNAを50 nMに希釈し、5 µLずつ分注して-80 °Cで保存します。

マイクロインジェクションの準備ができたら、ラベル化されたRNAの1アリコートを解凍し、70 °Cで5分間変性させます。次に、室温のマイクロ遠心機を用いて最大速度で10分間遠心分離し、粒子状物質を除去して氷上に保持します。続いて、卵母細胞を単離するため、Xenopus laevisの卵巣の断片を、3 mg/mLの溶液25 mLが入った50 mLコニカルチューブに入れます。

pH 7.4の0.1 Mリン酸カリウム緩衝液に含まれるコラゲナーゼ。バッチ間の変動があるため、18 °Cで穏やかに振盪してください。コラゲナーゼ処理時間は変動する可能性があるため、目視検査による慎重なモニタリングが必要です。

脱葉を確実に行うため、卵母細胞が卵巣から明らかに分離するまで、あるいは15分間、振盪を続けてください。その後、卵母細胞をコニカルチューブの底に沈殿させます。溶液を除去し、MBSHバッファーで置換します。この操作を繰り返し、合計3回洗浄してください。

次に、標準的な光学顕微鏡下で、ステージ3から4のCYTESとMBSHバッファーを分取します。ステージ3のcytesは完全に不透明ですが白色です。一方、ステージ4のcytesはわずかに大きく、色素の斑点が見られます。

わずかに透明な卵母細胞は若すぎ、完全に色素沈着しているか、または色素分布に極性が見られる卵母細胞は成熟しすぎています。最後に、3.5インチのキャピラリーを延伸および面取りし、外径約0.05 mmの針を作成して、マイクロインジェクション用の針を準備します。mRNA、卵母細胞、および針の準備が整いましたら、マイクロインジェクションに進みます。

まず、1回の注入あたり2 nmを投与するように、脱イオン水を用いて針の校正を行います。ガス制御式マイクロインジェクターを使用して針に充填し、マイクロメーターを用いて液滴サイズを校正します。校正後、注入するRNAを針にフロントロードします。次に、選別した卵母細胞をMBSH緩衝液が入った注入用ディッシュに配置します。このディッシュには黒色のフォームラバーの層が含まれています。

白い卵細胞は黒い背景に対して非常によく見えます。次に、50 nanomolarのRNAを2 liters、各卵細胞に慎重に注入してください。各卵細胞への注入は必ず1回のみとし、注入完了後は針に詰まりがないか定期的に確認してください。

残りのRNAを排出し、針を脱イオン水で洗浄してから、次に注入するRNAをロードします。注入後、注入済みの卵母細胞を滅菌済みの24ウェルプレートのウェルに移します。1ウェルあたり最大1,000個の卵母細胞を培養することが可能です。

バッファーを除去し、1ウェルあたり400 µLのocyte培養培地と交換します。次に、培養中の湿度を維持するため、濡れたペーパータオルを入れたプラスチック容器に培養プレートを入れ、18 °Cで8時間から48時間の範囲の所定の期間、卵母細胞をインキュベートします。注入した卵母細胞のインキュベーション後、顕微鏡観察用の準備を行うことができます。

死滅した卵母細胞を取り除き、生存している卵母細胞をガラスバイアルに入れる。通常、90%以上の卵母細胞の生存が観察される。バッファーをM-E-M-F-A固定液に交換し、細胞を20分間揺盪させる。

固定期間の終了後、固定中の卵母細胞を日光から保護してください。固定液を除去し、等量のMBSHバッファーに置換することで卵母細胞を洗浄します。この洗浄をもう一度繰り返し、合計2回洗浄してください。

次に、卵母細胞を無水メタノールで洗浄します。まず、液量の半分を取り除き、メタノールで置換します。この操作をさらに2回繰り返します。

これらの洗浄後、溶液をすべて取り除き、メタノールに置換します。このメタノール洗浄をもう一度繰り返します。固定および脱水した卵母細胞は、イメージングの準備が整うまで-20 °Cで保存できます。

イメージングの前に、ガラスボトムのWPIフルオロディッシュにMarie's clearing mediumを加え、イメージング表面を覆います。メタノールからフルオロディッシュへ、転送されるメタノールの量を最小限に抑えながら、慎重に卵母細胞を移します。倒立共焦点顕微鏡を用いて卵母細胞をイメージングします。Zeiss LSM 510およびLeica TCS SPの両方で良好な結果が得られます。ここで、マイクロインジェクション直後の細胞内RNA局在の代表的な画像を示します。蛍光標識したコントロールを8時間培養した後、核内に蛍光RNAが観察されます。

RNAが卵細胞の細胞質に均一に分布している様子が確認できます。しかし、輸送装置をリクルートする配列を含む蛍光標識RNAは、卵細胞の植物極へと細胞内局在化する過程にあることが分かります。ここまで、蛍光標識RNAを卵細胞にマイクロインジェクションし、共焦点顕微鏡でRNAの局在化を観察する方法について説明しました。

この手順を行う際は、培養液へのRNA混入を防ぐためにDEPC処理済みの溶液を使用し、抗生物質を含むOCMで卵母細胞を培養し、可能な限り卵母細胞を日光から遮光して光退色を防ぐことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。