個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース

本実験の目的は、生きたショウジョウバエのUサイトにおける動的プロセスを記録することです。まず、十分に給餌した2日齢の雌から完全な卵巣を単離します。次に、卵室をイメージングするために、卵巣から個々の卵管を抽出します。

その後、適切な蛍光タンパク質が発現していれば、個々の卵室を直接イメージングするか、あるいはイメージング前に蛍光マーカーを微量注入するなどのさらなる操作を行うことができます。最終的に、動画シーケンスの解析を通じて、細胞内コンポーネントの動的な相互作用を明らかにすることが可能です。この手法は、RNA輸送および局在翻訳の分野におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ってきました。

例えば、生体内でボディプランを構築するタンパク質の発現は、時間的・空間的にどのように制御されているのでしょうか。一般的に、この手法に不慣れな方は、かなりの速度と器用さが要求されるため、習得に苦労すると思われます。十分な練習を積むことで、より良い結果が得られます。

卵室の操作はテキストで伝えることが困難であり、また、忍耐強い技術的習熟と確実な手さばきが必要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。まず、カバーガラス上にハロカーボンオイルを少量滴下し、脇に置いておきます。次に、準備したショウジョウバエを二酸化炭素で麻酔させます。

先の鋭い精密ピンセットを使用し、腹部前方で太った雌のハエを掴みます。腹部の中央を掴まないようにしてください。雌のハエを、準備したカバーガラスから約2〜3 cm上の高さで保持します。

2組目のピンセットを使用して、雌の最後端にある組織を取り除きます。通常、これには腸組織が含まれますので、清潔なピンセットを用いてください。歯磨き粉をチューブから出すように、腹部を前方から後方に向かって緩やかにマッサージします。

卵巣は大きな不透明な構造体として見え、鉗子の先端に付着します。卵巣に触れてスライド上のHaloカーボンオイルに転写し、回収してください。その後、4〜6個の卵巣が集まるまでこの操作を繰り返します。

空中器官を分離する前に、顕微鏡の光源を調整し、照明がスライドに浅い角度で当たり、組織にコントラストのある影ができるようにします。ショウジョウバエを解剖する際は、適切な器具を使用することが非常に重要です。

使用するポインターは、組織を傷つけないよう鋭すぎない一方で、ピンセットを確実に保持できる程度の適度な鈍さを持たせています。同様に、ピンセットも組織を損傷させないよう鋭すぎないようにしますが、器具を曲げることなく操作できる十分な精度は確保しています。また、器具を清潔に保つことが非常に重要であるため、処置の間、閉じた鉗子を用いて定期的に器具を洗浄します。

後端の結合組織を取り除き、2つの卵巣を分離します。後端には最も成熟した卵室があります。卵巣を水平に配置し、最も若い卵室が利き手側にくるように向けます。

次に、残っている結合組織を持って後端をそっと掴み、解剖針またはタングステン針を使用して、個々の卵室を丁寧に分離します。ジャマー期からステージ10までの個々の卵室は互いに分離しますが、より成熟した卵室は卵巣に付着したままになります。プローブを用いて、分離した15〜25個の卵室を慎重にオイルドロップの中央まで移動させます。複数の卵巣を解剖する必要がある場合は、別の個体から1つ選択してください。

余分な卵巣組織は廃棄し、細胞がストレスによる表現型の変化を示し始めるため、迅速に作業してください。卵巣から解剖して40分後、オイルから余分な卵巣組織を取り除きます。中期の卵母細胞を注入するために、清潔な器具を用いて、カバーガラスの長軸に対して垂直に方向を合わせます。後期の卵室を単離するために。

前述のように卵巣の後端を把持した場合とは異なる方法が必要です。解剖用プローブを、鉗子の近くの卵巣後端に挿入します。卵室を穿刺しないよう、成熟段階にある卵室の間にプローブを挿入してください。

解剖針を卵巣の中へ通し、初期段階の卵室から出るまで引っぱります。正しく行われれば、プローブによって、卵管と後期段階の卵室を固定している結合組織が取り除かれます。卵管がカバーガラス上で広がるまで、この操作を繰り返します。

卵室が重なり合わなくなった時点で、このステップは完了です。解剖用プローブを使用して、後期段階の卵室を分離し、ステージ14を配置してイメージングしやすくします。ネックチャンバーについては、ピンセットを用いて背側付属肢を把持してください。

注入用溶液を高速で短時間遠心分離し、準備します。これにより、注入針を閉塞させる可能性のある固形沈殿物をペレット化します。次に、ローディングチップを用いて注入針に溶液を充填し、充填済みの注入針をインジェクターに慎重に取り付けます。

次に、サンプルの隣に小さなガラス片を配置し、スライドを顕微鏡ステージに固定します。このガラスは、壁として機能し、遮断または解除するために使用します。ニードルを外してください。

顕微鏡と注入装置を準備します。この際、針先を破損させないように注意してください。可能であれば、ポイントビジティング機能を備えた電動ステージを使用して、注入対象となるステージ8およびステージ9の細胞すべてにマークを付けてください。

次に、注入針をオイルに触れるまで下げます。マークされたポイントリストから最初のポイントを選択し、細胞に焦点を合わせます。細胞と同じ焦点平面にくるまで、手動で針を下げてください。

マニピュレーターのコントローラーを使用して、注入針の先端をU部位の内部に移動させます。ゆっくりと刺すよりも、素早く刺す動作の方が成功しやすい場合が多いです。内部に入ったら、針から少量の液を注入し、その効果を視覚的に確認します。

繰り返し操作が必要です。注入が成功すると、細胞内の細胞質が押し出されます。注入された液体の正確な量を定量することは困難です。

注入量を増やすには、注入パルスの圧力または時間を調整してください。また、ニードルの先端を折ることで開口部をわずかに広げるか、次の mark.Cyte を選択する前に、注入パルスを複数回適用してください。注入用ニードルは、他の cyte にぶつからないよう、オイルの中で十分に高く上げてください。

針を細胞内に何度も刺したり、長時間留めたりすると、卵室に深刻なダメージを与えます。そのため、迅速に行なってください。注入は10秒以内に完了させる必要があります。

操作に誤りがあった場合は、次の標的部位へ移動してください。損傷した部位に時間を費やさないようにします。針が詰まった場合は、針をガラスの破片の方へ移動させてください。

ガラスと針を同一の焦点面に合わせ、針をゆっくりとガラスに刺入します。注入ボタンを押し、針先から液体が出るかを確認して、針に詰まりがないことをテストしてください。すべてのUS部位への注入が完了したら、手動で針をオイルから出し、顕微鏡のビームパスの外に配置します。

眼への損傷を避けるため、安全な向きに配置されていることを確認し、消灯してください。蛍光イメージングを効率的に行うには、速度が不可欠です。卵室の単離から細胞注入までに1時間以上経過すると、細胞の注入が困難になり、ストレスに関連した表現型の変化が現れます。

同様の問題は、細胞の粗い取り扱いや過剰な量の注入によっても発生する可能性があります。trenchgenic蛍光タンパク質を発現している卵室は、注入を行うことなくイメージングが可能です。内因性RNAのMS2標識は、in vitroで合成された完全な手順を用いた組織分離の手順を用いることで、良好な結果でイメージングできます。

Alexa 546ラベル付きRNAをME 31 BGFP卵室に注入したところ、RNAは細胞の背側前方に局在し、核の周囲にキャップ状の構造を形成しました。この手法に習熟すれば、解剖からイメージング開始まで約10分で完了させることができます。この手順を行う際は、迅速かつ慎重に操作し、組織を傷つけないよう注意してください。このビデオを視聴することで、生存しているショウジョウバエの細胞におけるダイナミックなプロセスの記録方法について十分に理解できるはずです。