植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

植物細胞壁のリグニン含有量および組成の決定は、乾燥させた植物試料にさまざまな抽出処理を行うことから始まります。得られた試料は細胞壁のみで構成されており、これを分画してリグニン含有量を測定します。細胞壁試料をブロモアセチルで加水分解し、可溶化したモノマーをUV分光光度計で定量することで、リグニン組成を決定します。

細胞壁材料は細胞溶解によって加水分解されます。可溶化したリグニン成分は、その後、揮発性のトリメチルシリル誘導体に誘導され、ガスクロマトグラフィーと質量分析を組み合わせることで分離および定量が可能です。マトリックス多糖類の組成およびセルロース含有量の決定については、「Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates（植物細胞壁の包括的な組成分析 第2部 炭水化物）」という別のビデオで実演しています。

こんにちは。私はミシガン州立大学のグレートレイクス・バイオエネルギー研究センターにあるウォール分析施設の責任者、マーカス・ポーリーです。私は分析細胞壁施設のマネージャーを務めるクリフ・フォスターです。植物バイオマス試料の含有量および組成を決定する方法について解説します。

植物は太陽からの光エネルギーをバイオマスなどの化学エネルギーに変換します。植物のバイオマスは主に細胞壁で構成されており、細胞壁はすべての植物細胞を包み込む多様なポリマーの複雑なネットワークです。ここでは、豊富に存在する再生可能資源であるこれらのリグニンCellose Xをバイオ燃料に変換する可能性を評価するため、植物細胞壁材料の組成を決定します。

本日のビデオでは、「植物細胞壁の包括的な組成分析（第2部：炭水化物）」と題した別のビデオでポリフェノールであるリグニンについて取り上げます。ここでは多糖類分析に焦点を当てます。この手順を開始するには、2 mLのサレドスクリューキャップチューブに5.5 mmのステンレス製ボールを3個と、風乾または凍結乾燥させた植物試料を約60～70 mg加えます。

材料は、粉砕・分注ロボットであるeyewallを用いて微粉末に粉砕できます。eyewallはチューブを取り込み、30秒間振とうします。内部のメタルボールによって材料が微粉末に粉砕され、その後、粉砕されて凝集した植物粉末をほぐします。代替案として、ロボットを使用しない低スループットの手順もあります。レトロの手法を容易にする手順はパート2で示します。粉砕した材料に1.5 Mの70% aqueous ethanolを加え、十分にボルテックスし、室温で遠心分離します。

この処理により、ほとんどのタンパク質と細胞小器官が可溶化されます。上清を吸引し、アルコール不溶性ペレットに対して等量のクロロホルム・メタノール溶液を加えます。十分に振とうしてペレットを再懸濁し、遠心分離を行います。クロロホルム・メタノールによって脂質などの疎水性化合物が抽出されます。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを500 µLのアセトンで再懸濁します。

サンプルを乾燥させるには、35 °Cの空気気流を用いて溶媒を蒸発させ、乾燥するまで待ちます。乾燥したサンプルは、次の処理まで室温で保存可能です。サンプル残渣からデンプンの除去を開始するには、ペレットを1.5 mLの0.1 M 酢酸ナトリウム（pH 5）に懸濁させ、チューブに蓋をして加熱ブロックで加熱し、デンプンを糊化させます。懸濁液を氷上で冷却した後、デンプン分解酵素ミックスを加え、チューブに蓋をして十分にボルテックスミキシングし、懸濁液を一晩インキュベートします。

37 °Cのシェーカー内で、回転シェーカーを用いて適切に混合します。一晩のインキュベーション後、100 °Cのヒーティングブロックで10分間加熱し、消化を停止させます。その後、遠心分離を行い、可溶化デンプンを含む上清を廃棄します。

前述の手順に従い、ボルテックス、遠心分離、デカンテーションを繰り返し、残りのペレットを1.5 mLの水で3回洗浄します。最後に、ペレットを500 µLのアセトンに再懸濁し、35 °Cの気流で溶媒を蒸発させて乾燥させます。単離された細胞壁またはセルロースを含まないレグニンを含む乾燥試料が完成し、以降の解析に使用可能です。これらの試料は室温で保存できます。

まず、調製した細胞壁物質を1〜1.5 mg量り取ります。この物質は、手動で量り取るか、パート2で示すようにアイウォールを用いて自動的に量り取ることができます。チューブの壁面を250 µLのアセトンで洗浄して細胞壁物質をチューブの底に集め、気流下でアセトンを非常に緩やかに蒸発させます。

アセトンが蒸発した後、新鮮に調製した25%（v/v）氷酢酸中臭化アセチル100 µLを、容器の壁面に沿ってゆっくりと加えます。液跳ねを防ぐため、少量ずつ加えてください。臭化物はリグニンポリマーをアセチル化されたモノマーに分解します。その後、メスフラスコに蓋をし、50 °Cで2時間加熱します。

さらに1時間加熱し、15分ごとに4回振とうした後、最終的に氷上で冷却します。室温まで冷却した後、フラスコに2 M 水酸化ナトリウム 400 µLと、調製直後の0.5 M ヒドロキシルアミン塩酸塩 70 µLを加え、メスフラスコをボルテックスします。次に、氷酢酸を用いてメスフラスコの2 mL標線まで正確に満たし、溶液を中和させます。キャップを閉め、数回反転させて混合します。加水分解および可溶化したモノリスを含む溶液 200 µLをUV専用の96ウェルプレートにピペッティングし、マイクロプレートリーダーを用いて280 nmで測定します。粒子によって吸光度にわずかな変動が生じる可能性があるため、プレートを少なくとも3回読み取り、吸光値の平均を算出します。

書面によるプロトコルに提示された式を用い、適切な植物係数を使用して、臭化物可溶性リグニン（BSL）の割合を決定します。リグニンは主に p-ヒドロキシフェニル、グアイアシル、シリンギル単位の3つのサブユニットで構成されるポリフェノールネットワークであり、植物試料中のリグニン組成を決定します。まず、約 2 mg の細胞壁材料を、細胞溶解用のねじ蓋付きガラスチューブに移します。

次に、2.5% ボロン三フッ化物エチルエーテルおよび 10% エタンチオールジオキサン溶液の調製準備を行います。ジオキサンは非常に危険であるため、サンプルや器具をフードの外に持ち出さないでください。細心の注意を払って作業し、窒素ガスを満たしたバルーンを使用して、ジオキサンボトルの減少した容量を窒素で置換してください。

1サンプルあたり、175 µLのジオキサン、20 µLのETSH、5 µLのBF3を混合して溶液を調製します。混合後、各サンプルにこの溶液を200 µLずつ加えます。バイアルのヘッドスペースを窒素ガスでパージし、キャップを閉めます。

直ちにサンプルを100 °Cで4時間加熱し、1時間ごとに緩やかに混合します。その後、溶血反応を氷上で5分間停止させます。次に、中和のために0.4 M 重曹（炭酸水素ナトリウム）を150 µL加え、ボルテックスミキサーで撹拌します。

リグニン分解産物の精製のため、1 mLの水と0.5 mLの酢酸エチルを加え、ボルテックスした後、相分離させます。酢酸エチルの層が上層に、水層が下層になります。リグニン成分を含む上層の酢酸エチル層から150 µLを、水が混入しないように注意して2 mLチューブに移します。

上層の酢酸エチル層を回収した後、エア濃縮機を用いて溶媒を蒸発させます。アセトンを200 µL加え、蒸発させます。過剰な水分を除去するため、このアセトンによる処理を2回繰り返します。

次に、リグニン成分を揮発性のトリメチルシリル誘導体に誘導します。各チューブに500 µLの酢酸エチル、20 µLのピリジン、および100 µLのN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドを添加します。25 °Cで2時間インキュベートします。

2時間後、反応液100 µLをGC MSバイアルに移し、100 µLのアセトンを加えます。四重極質量分析計または水素炎イオン化検出器を備えたGCを用いてサンプルを分析します。カラムおよび分析条件の詳細については、付属の書面プロトコルを参照してください。

ポプラ材を植物材料として用いたリグニン分析の代表的な結果を以下に示します。この分析によると、ポプラ材料の22%がポリフェノールリグニンで構成されています。リグニン成分の組成はGCMSによって分析されました。

ピークの同定は、内部標準としてテトラコサンを用い相対的な保持時間に基づいて行うか、またはsgおよびhモノマーに特有の質量スペクトルイオンである2 99 MZ、2 69 MZ、および2 39 MZを用いて行います。リグニン成分の組成は、総ピーク面積を100%として定量します。組成分析の結果、この特定のサンプルには主にシリンギル（S）ユニットが含まれていることが示されました。しかしながら、グアイアシル（G）ユニットも豊富に含まれています。

当然ながら、量およびモノリグニトール単位の組成は、植物組織や種によって異なります。ここでは、多糖類分析のための植物材料のリグニン含有量および組成を決定する方法について説明しました。パート2へ進んでください。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。