植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

植物細胞壁のマトリックス多糖組成および結晶性セルロース含有量の測定は、乾燥させた植物試料から開始し、さまざまな抽出処理を行います。得られた試料は細胞壁のみで構成されており、その後、マトリックス多糖組成を決定するために分割されます。細胞壁試料を弱酸で処理し、非結晶性多糖（主にヘミセルロース）を単糖に加水分解します。

その後、単糖類を対応する揮発性アルドール酢酸に誘導体化し、ガスクロマトグラフ質量分析計で分析・定量することで、結晶性セルロースの決定を行います。細胞壁は、非結晶性の壁成分を除去する酸の混合物であるグラフ試薬で処理します。残った結晶性セルロースを単量体であるグルコースに分解し、これを比色法で測定します。

リグニン含有量および組成の測定については、別のJoVEビデオ出版物「Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin」で詳しく説明しています。こんにちは。ミシガン州立大学のGreat Lakes Bioenergy Research Centerにて、Cell Wall分析施設の責任者を務めているMarcus Pauleyです。私はCell Wall分析施設のマネージャーを務めているCliff Fosterです。

本日は、さまざまなホモセルロースにおけるセルロースである植物細胞壁材料に存在する多糖類の組成を決定する方法について説明します。ここグレートレイクス・バイオエネルギー研究センターでは、これらの糖をバイオ燃料に変換する技術を開発しています。最適な植物原料を特定するためには、まずこのバイオマスにどのような種類の糖がどの程度含まれているかを評価する必要があります。

「植物細胞壁の包括的な組成分析：パート1 リグニン」と題された別のビデオでは、ポリフェノール分析に焦点を当てます。それでは始めましょう。まず、細胞壁を単離することからこの手順を開始します。

乾燥させた植物試料約60～70 mgを、2 mlのSAR TEDスクリューキャップチューブ内で、5.5 mmのステンレス製ボールを用いて粉砕します。ハイスループットな代替手段としてREMミルを使用する場合は、パート1で説明したeyewallと呼ばれる粉砕・分注ロボットを使用してください。粉砕が完了したら、ステンレス製ボールを取り出します。

パート1に示され、付随する書面プロトコルに記載されている通りに、細胞壁の単離と残留デンプンの除去を継続します。2 mgのDSデンプン細胞壁物質を2 mLサレッドチューブに量り取ります。この作業をハイスループットに行うには、eyewallロボットが有効です。

ロボットが粉砕した植物試料を含むチューブを取り出し、チューブの底に穴を開けます。穴を開けたチューブをVIフィーダーにセットします。空のチューブを天秤に載せ、振動によってVIフィーダーの下へ移動させます。試料が上のチューブの穴から浸透して下の空チューブに入り、所定の量が蓄積されるまでこの操作を繰り返します。

内部標準として100 µgのアセトールを添加します。チューブ壁をアセトンで洗浄して、細胞壁物質をチューブの底に回収し、気流下でアセトンを非常に緩やかに蒸発させます。次に、弱酸加水分解を行います。

各サンプルに2 Mのトリクロロ酢酸またはTFAを250 µL慎重に加え、チューブの壁面に液が跳ね上がらないようにしてください。チューブの蓋をしっかりと閉め、ヒーティングブロックを用いて121 °Cで90分間インキュベートします。その後、ヒーティングブロックとサンプルを氷上で冷却し、チューブを10,000 RPMで10分間遠心分離します。

マトリックス多糖類の可溶化糖を含む酸性上清100 µLを、ペレットを乱さないように注意しながらスクリューキャップバイアルに分注します。このペレットは結晶性セルロース分析に使用できます。蒸発装置を用い、ガラスチューブ内のTFAを緩やかな空気流で蒸発させます。

過剰な酸を除去するために、2-プロパノールを300 µL加え、ボルテックスして25 °Cで蒸発させます。この操作を計3回繰り返します。ガスクロマトグラフィーで単糖類を同定できるようにするため、アルドール酢酸エステル誘導体化を行います。

まず、単糖を対応する開環アルドールに還元し、次にアセチル化します。詳細な手順については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。手順の各ステップは、先に示したプロトコルに従い、試薬の添加、インキュベーション、気流下での蒸発を行い、その後、さまざまな洗浄ステップによって過剰な試薬を除去します。

最終ステップとして、アルドール酢酸エステルを抽出します。まず、500 µLの酢酸エチルを加え、軽く回旋させます。次に、2 mLの水を加え、チューブに蓋をしてボルテックスし、2000 RPMで5分間遠心分離します。これにより、上層にアルドール酢酸エステルを含む酢酸エチル層、下層に水層という明確な二層分離が得られます。酢酸エチル層から50 µLをインサート付きのGC-MSバイアルにピペットで分取します。GCバイアルに100 µLのアセトンを加えて希釈し、このGCバイアルを4 °Cで保存することが可能です。

GC-MS分析をすぐに開始できない場合は、四重極質量分析計を備えたガスクロマトグラフにサンプルを注入してください。カラムおよび分析の詳細については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。結晶性セルロース含有量を決定するための出発材料は、単離した細胞壁材料、または弱酸であるTFAで処理済みの壁材料（酸処理直後、または保存可能な乾燥状態のいずれか）を使用できます。

前述のようにイソプロパノールで過剰なTFAを除去した後、2 Mのsars内のTFAペレットに、酢酸、硝酸、水で調製した1 Mのup degra試薬を、体積比8:1から2:1で加えます。チューブの蓋をしっかりと閉め、ボルテックス後、ヒーティングブロックを用いて100 °Cで30分間加熱します。この処理により、ペレット内には結晶性セルロースのみが残ります。

その他のすべての多糖類は加水分解します。ブロックを用いて、サンプルを氷上で室温またはそれ以下まで冷却します。次に、サンプルを10,000 RPMで15分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さず、またペレットの一部を除去しないように注意して上清を捨てます。このため、チューブ内に上清を約150 microliters残し、ペレットを水で数回洗浄してください。

次に、結晶およびセルロースペレットを完全にグルコースまで加水分解するため、濃硫酸を用いて酸加水分解を行います。まず、sartaチューブに72%硫酸を175 µL加え、室温で30分間インキュベートします。最初のインキュベーション後、サンプルをボルテックスし、さらに15分間インキュベートします。

次に825 µLの水を加え、ボルテックスした後、サンプルを10,000 RPMで5分間遠心分離します。チューブ内には、主にリグニンと思われる茶色の可溶性物質が残る可能性がありますが、グルコースは上清に含まれます。上清中のグルコース含量をアントロン比色法を用いて測定します。

このアッセイは、96ウェルポリスチレン製マイクロタイタープレートを用いて行います。付属の書面プロトコルの指示に従い、グルコース標準曲線をデュプリケートで作成します。各サンプルの上清10 µLと水90 µLを混合し、標準試料と同じマイクロタイタープレートの別々のウェルに分注してサンプルを調製します。最後に、調製直後の試薬200 µLを加えて完了します。

次に、アルミ製ヒートスプレッダーを用いたオーブン内で、プレートを80°Cで30分間加熱します。加熱完了後、グルコース含有サンプルが黄色から青緑色に変化することを確認してください。プレートを室温まで冷却し、十分に振とうします。

マイクロプレートリーダーを用いて625 nmにおける吸光度を測定します。セルロースの構成単位であるグルコースの含有量は、同一プレート内で作成した標準曲線に基づいた吸光度から算出します。以下に、ポプラ材の多糖類分析における代表的な結果を示します。

ガスクロマトグラムのピークは、標準物質のマスプロファイルおよび／または保持時間によって同定されます。単糖類は標準曲線に基づいて定量します。マトリックス多糖類の糖分析では、ヘミセルロースを示すキシロースが多量に検出されましたが、その他の糖も存在しています。

分析によれば、ポプラ試料の40%が結晶およびセルロースで構成されています。これらの含有量および組成は、個々の植物間や、同一植物内の異なる部位によって異なる場合があることに注意してください。以上で、ポリフェノールリグニンの分析に向けた、リグノセルロース系バイオマスの多糖類含有量の決定および組成分析の方法を説明しました。

パート1をご覧ください。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。