スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

このビデオでは、Styro Dye FM 1 43 の光変換の手順を実演します。drosophila melanogaster のシナプス小胞プールを研究するために、まずショウジョウバエの幼虫を解剖し、神経筋接合部（NMJ）標本を構成する腹側筋肉を露出させます。この標本を、細胞膜を標識する FM D（ここでは灰色で表示）を含む緩衝液中でインキュベートします。

その後、電気的または化学的な刺激を与えて物理的な融合を誘導し、それに続いて小胞膜を内部移行させます。刺激による開口放出はFMダイで染色します。次に、細胞外のFMダイを洗浄して細胞膜から除去し、高強度の照明を連続的に照射しながら組織を固定します。ダイは完全に退色し、ジアミノベンジジンの沈殿によって黒色に発色します。

この沈殿物は、透過電子顕微鏡（TEM）で視覚化することができます。こんにちは。私はドイツのガオンにある欧州神経科学研究所のSylvia Olli研究室のPhilippe o Pasoです。本日は、神経筋接合部におけるFM光変換の手順についてご紹介します。

当研究室では、シナプス小胞のリサイクルを研究するためにこの手順を用います。それでは、開始しましょう。解剖顕微鏡下で操作を行います。まず、シルガードでコーティングしたディッシュに、ショウジョウバエの幼虫を背側が上になるようにピンで固定します。

シリンジの針を用いてショウジョウバエ用生理食塩水をかけ、解剖用ハサミで背面を縦方向に切開します。次に、内臓を取り除きます。その後、サンプルを広げ、再びシャーレにピンで固定します。

その後、いくつかの腹側筋肉を用いて、本手順で使用するFM染料を退色から保護することができます。この手順は低照度条件下で実施してください。ピンセットで固定したショウジョウバエの標本を、90 millimolar 塩化カリウムおよび10 micromolar FM 1-43を含むショウジョウバエ生理食塩水で覆い、神経を化学的に刺激します。

刺激後、室温で1分間インキュベートします。刺激溶液を除去し、化学安全フード内で、100 mLのショウジョウバエ生理食塩水を満たしたビーカーに、個体を固定したディッシュを2回浸し、細胞外のFM 1-43色素を除去します。

神経筋接合部の標本を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製した2.5%グルタルアルデヒド中で、室温で45分間固定します。標本をPBSで1回洗浄し、シガーディッシュから取り出して100 millimolar 塩化アンモニウムに15分間浸漬します。これは、残留しているグルタルアルデヒド固定剤の遊離アルデヒド基をクエンチするためです。

通常のPBSで塩化アンモニウム溶液を洗浄し、神経筋接合部の標本を新しいシガーディッシュに移して、フィルターろ過した1.5 mg/mLのジアミンベンジジン（DAB）含有PBSに浸し、4°Cで30分間インキュベートします。バックミラー付きのランプハウジングを備えた水銀ランプ光源搭載の蛍光顕微鏡の下に試料を配置し、比較的低倍率のドライ対物レンズを用いて観察します。

サンプルを探します。次に、通常のブルー励起・グリーン蛍光フィルターキューブを使用して、蛍光信号に焦点を合わせます。神経筋接合部は、筋肉上の明るい点として現れます。

次に、同じ蛍光フィルターセットを使用して、FM Dが完全に退色するまで最大強度でサンプルを照射します。20倍の対物レンズを使用した場合、30～45分で十分なはずです。ただし、光変換にかかる時間は、照射強度、標本へのDABの浸透強度、および使用する対物レンズによって異なります。

照射後、透過光でサンプルを観察します。光変換が起こっている場合、暗褐色の沈殿が見られるはずです。解剖顕微鏡に戻り、ハサミを使用して幼虫から光変換した部位を切り出します。

解剖顕微鏡に戻ります。次に、はさみを用いて、幼虫から光変換されたスポットを切り出します。その後、手袋や保護メガネなどの適切な安全装置を着用し、化学薬品用安全フード内で、サンプルをPBSの入ったマイクロ遠心チューブに移します。

サンプル1個あたり300 µLの1%四酸化オスミウムを調製します。次に、サンプルをプラスチック蓋付きのガラスフラスコに入れ、調製した四酸化オスミウム溶液を加えて固定処理を行います。サンプルのインキュベーション中に、30%、50%、70%、90%、95%、および100%の各エタノール溶液を個別に調製します。

サンプルをPBSで5分間ずつ、4〜5回洗浄します。洗浄ごとに、ピペットにプラスチック製PEsを使用してサンプルを新しいフラスコに移動させてください。最後の洗浄後、サンプルを清潔なガラスフラスコに移します。

次に、サンプルを段階的なエタノール溶液に浸し、脱水を行います。まず、1 mLの30%ethanolでインキュベートします。5分後、パステラーピペットを用いてエタノールを除去し、1 mLの50%ethanolと置換します。

脱水処理を続け、神経筋接合部の試料を70%、90%、続いて95%の溶液でインキュベートします。その後、試料を95%エタノール溶液で数回インキュベートし、脱水後、100%エタノールで3回インキュベートします。1:1のEIN樹脂を2mL加え、試料をロータトレーにセットしてインキュベートします。

100% EINで回転させた後、室温で2～4時間保持し、その後サンプルを開口フラスコに入れ、残りのエタノールが蒸発するように4～6時間放置します。新鮮なEINを型に注ぎます。調製物を加え、60 °Cで36時間インキュベートします。

EIN包埋試料の準備が整ったら、ウルトラミクロトームとダイヤモンドナイフを用いて、厚さ 50 to 80 nanometer の薄切片を作成します。試料を薄切します。切片はナイフの水槽上に浮遊するため、その後、通常のEMグリッドで回収することができます。

これで、従来のEM手順を用いてイメージングを行う準備が整いました。Drosophila melanogasterから単離した神経筋接合部を、高カリウム濃度で刺激し、膜の内部移行を誘導しました。ここでは、FM 1-43を用いて染色した様子を示しています。

神経末端の蛍光は、一般的な落射蛍光顕微鏡を用いて観察することができます。連続照射下では、色素は完全に退色し、さらに照射を続けると、ジノベンジンの沈殿により黒色が出現します。この神経末端にはシナプス小胞が含まれていますが、それらのいずれも光変換はされていません。

これは、照明不足または組織へのDIAアミノベンゼンの浸透不十分が原因である可能性があります。対照的に、照明が強すぎると全体的に末端が暗くなり、小胞やオルガネラを識別できなくなります。適切な量の照明による光変換は、適切に観察可能です。この顕微鏡写真では、暗い小胞の集まりが見えるシナプスボタンが示されており、FM光変換が起こっていることがわかります。

femダイで標識したシナプス小胞を光変換する方法について説明しました。この手順を行う際は、変換ステップにおける照射時間を常に注意深く校正することが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。