のシナプス変調を分析

本実験手順の全体的な目的は、異なる活性化条件下における単一ニューロンのシナプスダイナミクスを理解することです。この手法は、ニューロンの活動の成熟に伴うシナプスの分子組成の変化を明らかにすることなど、シナプス可塑性分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、シナプス数、分布、およびシナプス後の分子成分の濃縮レベルを含む、シナプスの多面的な半自動解析が可能になることです。

本実験では、羽化から6時間以内にハエを通常のバイアルに回収します。回収用バイアルを透明アクリルラックにセットしてください。25 °Cに設定した小型インキュベーター内で、光強度が平均1000 luxとなるよう、LEDパネルから正確な距離にラックを配置します。

その後、定常暗黒、12時間明期・12時間暗期、または定常明期のいずれかの条件下で、ショウジョウバエを1〜3日間飼育します。後日、標準的な手法を用いて脳を摘出し、染色します。ハエの脳を封入するには、マイクロピペットに封入剤を充填し、顕微鏡スライドの中央に2 µLのドロップを約2 cmの間隔で2滴滴下します。

各液滴の上にカバーガラスを配置し、隙間を約0.2 mmにします。次に、カバーガラスの上および隙間に15 µLのマウント剤を滴下します。実体顕微鏡下で、マイクロピペットを用いて脳を隙間に導入します。

その後、脳を腹側が上になるように配置します。最後に、カバーガラスを取り付け、縁に沿って透明なマニキュアで封印します。これで、標準的な手法を用いて脳を撮像し、3D画像を再構成させることができます。

本例では、star法を用いて、Brp発現が活性な細胞におけるGFP蛍光を記録しています。また、本例ではR7およびR8光受容体軸索を抗ciaoptinで免疫標識し、RFPタグ付き二次抗体を用いて観察しました。Brp GFP punctaの数、分布、および脱局在化レベルを定量化するために、まずイメージスタックから作成した脳の再構成3D画像を読み込みます。

Brp punctaを白色で表示しています。次に、関心領域を特定します。この例では、M3 medulla層への進入点においてanticiaoptin陽性軸索が細くなっている箇所を追うことで、R8軸索の末端を特定します。

各R8軸索末端において、スポット検出モジュールを使用してBrp GFPのパンクタを特定します。「add new spots」を選択し、アルゴリズム設定で「segment only region of interest」を選択します。解析領域を定義したら、ソースチャンネルをBrp GFPに設定し、推定XY直径を0.35 micronsに設定します。

次に、スポット検出の「background subtraction（背景減算）」にチェックを入れます。続いて、フィルタータイプとして「quality（品質）」を選択すると、puncta（点状構造）が自動的にフィルタリングされます。「finish（完了）」をクリックして、この手順を終了します。

データセット内のすべてのR8軸索に対して、スポット検出法を繰り返します。次に特定する領域は軸索細胞質です。まず、surface関数を用いてサーフェスオブジェクトを作成します。

次に、「add new surfaces」を選択し、アルゴリズム設定で「segment only region of interest」をオンにします。続いて、関心領域（ROI）を手動で選択してください。その後、計算パラメータを設定します。

光受容体チャネルをソースとして検出するには、smoothオプションを選択します。しきい値には、absolute intensityを選択してください。split touching objectsオプションを有効にします。

シートポイントの直径を0.5 micronsに設定し、品質およびボクセル数についてはデフォルトのフィルター設定を使用します。これにより、フィルターが自動的に適用されます。次に、「編集（edit）」に移動し、関心領域外に生成されたサーフェスの断片を削除します。

このケースでは、他の軸索について同様に処理します。データセット内のすべてのR8軸索に対して軸索領域の検出を繰り返すことで、すべてのBrpパンクタとR8軸索がスポットオブジェクトの集合として識別されます。また、対応する細胞質領域はサーフェスオブジェクトとして識別されます。

次に、各軸索の向きと空間を手動で定義します。これは、後で髄質ニューロパイルにおける各ニューロンに沿ったBrp GFP密度の定量化を行うために重要です。まず、それぞれの始点と終点を定義してください。

「add new measurement points」を選択し、次に「edit」を選択してから、「select surface of object」を選択して、表面オブジェクトの上部を操作します。開始点を定義するために、M1層にあるR軸索のすべての表面オブジェクトに測定点を配置します。これらの点は、体系的かつ再現可能な順序で配置してください。

次に、終点を定義します。[add new measurement points]を選択し、[edit]、そして再び[surface of object]を選択します。その後、同様の系統的な順序で、M3層にあるR軸索の底部に測定点を配置します。

Brpのバックグラウンド強度を定量化するため、2本のR7軸索の細胞質領域を解析します。[add new surfaces]を選択し、R8軸索で行ったのと同様に、R7軸索の領域を手動で定義します。[enable split touching objects]オプションをオンにしない以外は、同一の設定を使用してください。

これは除外してください。次に、定義されたR7軸索領域内にダミーのスポットオブジェクトを追加します。「add new spots」を選択し、「skip automatic creation」を選択して、手動で編集します。

次に、「center of object」を選択し、サーフェスオブジェクトをクリックして、R7軸索内にダミースポットオブジェクトを配置します。同様に、2本目のR7軸索に対しても、サーフェスおよびスポットの検出ステップを繰り返します。その後、R8軸索で行ったのと同様に、R7軸索の始端と終端のターミナルポイントを定義します。

この解析を行う前に、正しいソフトウェアがインストールされていることを確認してください。スポットデータ、サーフェスデータ、およびそれぞれに同数の測定点を含む2つの測定点オブジェクトが含まれたデータセットを開きます。データを点検してください。

計算を正しく行うためには、両方の測定点オブジェクトに同じ数の測定点が含まれている必要があります。スポット、軸索領域、および開始点と終了点を定義した後、プラグインを起動します。まず、メタデータ、特にボクセルサイズを確認してください。

「編集」から画像のプロパティを開き、「ジオメトリ」の「座標」にあるボクセルの3次元サイズとミクロン単位を確認します。次に、強度解析を行うチャンネルを選択します。ここでは、Brp GFPを示すチャンネルを選択します。

次に、結果のファイル名を定義します。続いて、ビンの数を10に定義し、軸索の長さを100%に設定します。次に、スポット半径を0.35 micronsに、周囲の細胞質領域を50 micronsに設定することで、punctaの領域を定義します。最後に、シナプス検出コマンドを実行し、その後、出力を統計的に分析します。

記載されたプロトコルに従い、定常暗所、定常明所、または通常の明暗サイクルに曝露したハエのR8シナプスにおけるBrp GFP punctaを解析した。定常明所で飼育したハエのR8光受容体では、Brp punctaの数が有意に減少していた。punctaの分布は、カスタムプラグインを用いて算出した。

R8シナプスはM1層からM3層までの軸索シャフト全体に分布していましたが、その密度はM1層およびM3層でより高くなっていました。同様に、パンクタの脱局在化レベルを算出しました。それらはすべての条件下で変化しませんでしたが、Brp GFPの脱局在化レベルは、持続光下で明らかに拡散するBrp-short-cherryなどの他のリポーターとは異なっていました。

AZから分解された後、Brpショートフラグメントが不適切に処理されている可能性があります。このビデオを視聴することで、単一ニューロンにおけるシナプス可塑性特性の解析方法について深く理解できるはずです。このような可塑性特性には、シナプス数、その分布、およびシナプス形成後の特定の分子成分の濃縮ラベルが含まれます。