空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

嗅上皮の標本をディッシュに固定し、加湿空気の流れの中に置きます。解剖顕微鏡下で、緩衝液を介して参照電極を組織に電気的に接続します。次に、記録電極を嗅上皮の表面に配置します。

コンピュータ制御によるにおい物質のパフを加湿空気流に載せて投与し、嗅上皮を刺激します。この空気流によってにおい物質が嗅上皮へと運ばれます。EOG信号はアンプとデジタイザーを介して記録用コンピュータに送信されます。こんにちは、ジョンズ・ホプキンス大学生物学部のLaboratory of Hygiene XOのCatherine Ciarです。

本日は、マウスから電気嗅覚図（electro-olfactogram）を記録する手順をご紹介します。当研究室では、臭気に対する嗅覚感覚ニューロンの反応を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。

記録装置は、記録電極、参照電極、空気供給管、試料ステージ、および解剖顕微鏡で構成され、これらはすべてファラデーケージ内のエアテーブルに固定されています。電極を空気供給管内に配置するために、マイクロマニピュレーターが使用されます。連続的な気流を蒸留水の中にバブリングさせて加湿し、その後、空気供給管を通って試料の上に送ります。

標本の固定面として、厚さ6〜8 mmのガードで調整された60 mm培養皿を使用します。固定皿内のガードには、ウェルとチャネルが形成されています。これは、修正リンゲル液を介して参照電極を標本に電気的に接続するための手段を提供するためです。

記録電極と参照電極をアンプに接続します。アンプからの信号はデジタイザに送られ、その後コンピュータに転送されます。刺激プロトコルの制御、信号の記録、および応答の解析には、XI graphソフトウェアを使用します。

記録電極の設置時およびEOG記録中の電位をリアルタイムでモニタリングするため、増幅器の後段にオシロスコープを接続します。嗅覚刺激の提示はピコスプリッツァーで制御し、この装置は信号収集に使用しているコンピュータと同じコンピュータに接続されており、刺激提示の直前に制御されます。

ピコスプリッツァーの出力を、液状の臭気物質が入った臭気ボトルに接続します。次に、ボトルを空気供給チューブに接続します。それでは、記録実験のための電極の準備方法について見ていきましょう。

記録電極は、修飾リンゲル液を満たした引き伸ばしガラスキャピラリーに入った塩化銀線である。参照電極は塩化銀線である。電極ホルダーに銀線を装着し、両電極の準備を開始する。

記録電極については、電極ホルダーの端から1〜2 cmのワイヤーを突き出させます。参照電極の場合は、より長いワイヤーを残しても構いません。塩化銀コーティングを施すには、ワイヤーを0.1 molar 塩化ナトリウム溶液に浸し、電極ホルダーを1.5〜9 Vの直流電源の正極に接続します。

電源の負極を0.1 molar 塩化ナトリウム溶液に電気的に接続します。記録電極と参照電極の間の静電電荷を等しくするため、塩素反応を10分間進行させます。電極を記録装置に取り付ける前に、電極同士を軽く接触させてください。

次に、マイクロピペットプラーを用いてガラスキャピラリーを延伸します。キャピラリー先端の開口径は5〜10 µm程度にしてください。ダイヤモンドペンシルでキャピラリーの鈍端に傷をつけ、銀線よりも約2 cm長くなるように切り離します。

ブタン torches を使用して切断端を火炎研磨し、0.5% agros を含んだ修正リンガー液を溶解させます。加熱して細長く引き延ばしたシリンジを用い、転送ピペットで溶融した agro solution を少量、電極の先端に引き込みます。引き延ばしたキャピラリーの約半分まで充填してください。

修正リンガー液を用いて、キャピラリーを軽く弾き、気泡を取り除きます。充填した電極は、底部に少量の修正リンガー液を入れた保存瓶に、使用直前まで保管してください。組織サンプルの準備が整い、記録が可能な状態になったら、充填済みのキャピラリーを記録電極線に取り付け、電極を準備します。

記録のための組織調製を行う記録実験について見ていきましょう。犠牲にしたマウスの頭蓋骨上の皮膚を除去し、頭部を正中線に沿って等分に二分します。頭部の半分を内側が上になるように固定皿に固定してください。その後、鼻甲介を露出させるために、鼻中隔を慎重に除去します。

組織を固定したディッシュを記録ステージに置きます。顕微鏡の下に比甲介骨の記録部位が中心にくるようにステージを調整します。次に、エアタンクのバルブを開き、比甲介骨の表面に毎分約600 millilitersの加湿空気を供給します。

空気供給チューブを、記録位置から約 10 millimeters 離れた場所に配置します。AC増幅はEOG信号にアーティファクトを誘発するため、アンプをDCモードに設定してください。ローパスフィルターを 1 kilohertz、ゲインを 100 x に設定して記録します。

次に、記録電極と参照電極をマイクロマニピュレーターに取り付けます。参照電極をマウンティングディッシュのウェル内に下げ、組織と電気的に接続されるように修正リンガー液で満たします。記録電極を、比甲介鼻甲介2Bまたは3の表面に慎重に降ろします。

電極が嗅上皮の表面にわずかに触れるようにしてください。電極が上皮に接触すると、オシロスコープに直線的なベースラインが表示されます。次に、コンピュータに接続された空気供給チューブのサイドポートに、臭気物質のボトルを取り付けます。

刺激プロトコルを開始します。データ収集のサンプリングレートは2 kHz以上に設定してください。ソフトウェアが臭気パルスをトリガーし、記録を開始します。

一般的な刺激プロトコルとしては、持続時間100ミリ秒のシングルパルス対、1秒の間隔を空けた100ミリ秒のパルス、または10秒間の持続パルスなどが挙げられます。順応を最小限に抑えるため、高濃度の臭気を提示した後は、プロトコル間に1分から5分の間隔を設けてください。チューブ内に臭気が残留する場合があるため、追加の組織サンプルに進む前に、エアチューブを95%ethanolで洗浄し、乾燥させてください。

Axo graftソフトウェアは、EOG信号の主要なパラメータを測定するためのツールを提供します。これらのパラメータには、応答振幅、潜時、ピーク到達時間、および終結時定数が含まれます。EOGのいくつかのパラメータ、特に応答振幅、潜時上昇時間、ピーク到達時間、および終結時定数は、マウス間での正規化された応答を比較する際に特に有用です。

ここでは、濃度の異なる液体酢酸アミル刺激に対するマウスのOGを示しています。上部の黒線は、臭気刺激のタイミングと持続時間を示しています。ここでは、マウス5匹の平均による用量反応関係が示されており、エラーバーは95%信頼区間を表しています。

非常に高い臭気濃度では、ピーク振幅の低下がしばしば観察されます。対ペアパルス刺激に対するEOGの例が示されており、単一の短時間の臭気パルスによって数秒間持続する適応が誘発されます。ここでは、10秒間の持続的な臭気刺激に対するEOGを示しています。

EOGでは、臭気物質の連続提示中に脱感作が起こることが示されます。ここでは、マウスから電極ファクトグラムを記録する方法を説明しました。この手順を行う際は、電極を上皮の表面にのみ配置し、表面下に突き刺さないようにすることが重要です。

ばらつきを最小限に抑えるため、常に頭部の同じ側から記録を行い、セットアップの変更を避けてください。組織は湿潤状態に保ちますが、液滴が溜まらないようにしてください。解剖後すぐに組織を加湿空気下に置くことで、記録に最適な状態で組織を維持できます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。