光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動

この実験の全体的な目的は、マウスを麻酔して頭蓋骨を露出させた後、内因性光学信号およびフラボタンパク質自家蛍光信号（FASイメージング）を用いて、マウスの嗅球表面における臭気誘発活性をマッピングすることである。嗅球上の骨を薄くし、メスを用いて骨片を切り出し、除去する。その後、歯科用セメントでチャンバーを作成し、露出した嗅球表面を囲む。

これをアガロースで満たし、この調製物の上にカバーガラスを配置します。同一のマウスを用いて、内在性光学信号およびFASイメージングにより嗅覚マップを順次取得します。光学反射および自己蛍光信号を用いてマウス嗅球内の他の誘発活性をイメージングすることで、嗅球における嗅覚秩序の空間的コーティングに関する重要な疑問への回答に役立ちます。2光子グルコースイメージングやfMRIなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、単一の糸球体という空間解像度で嗅覚誘発活性を記録できることです。

一般的に、これらの手法に不慣れな人は、外科的なスキルと器具の操作スキルの両方を習得するのに時間がかかるため、作業初期に困難を伴います。外科的処置およびイメージング手順の重要なステップに注目するためには、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。マウスの後肢をつまんで麻酔状態を確認し、バリカンを用いて頭部の被毛を除去します。

蒸留水に浸した滅菌ガーゼパッドで、皮膚に残った被毛を拭き取ります。鼻先と後頭部が同一平面上になるように、マウスをステレオタキシックフレームに固定します。嗅球を水平に配置するため、耳バーとノーズバーをしっかりと固定し、動きを防ぎます。

イメージング中の乾燥を防ぐため、眼科用軟膏を眼に塗布し、その後、滅菌したハサミを用いてベタジーンで頭皮領域を消毒します。耳の間の後頭部を切開し、次に両側を耳の付け根に向かって、および前後の方向に眼瞼に沿って額に向かって切開します。鼻先の皮膚を切断して、頭皮の除去を完了させます。

ノーズバーをガイドとして使用します。実体顕微鏡下で動物を配置し、生理食塩水に浸した綿棒を用いて、頭頂部の骨膜を慎重に剥離させます。ピンセットで残りの組織を除去し、メスで頭蓋骨の表面を掻き出し、清潔な状態で準備します。実験を通して嗅球領域に水分を保持するようにしてください。

蒸留水に浸した吸収性ゼラチンスポンジを、両眼間に位置する嗅球上の骨の上に置きます。ゼラチンスポンジを取り除き、10番のメスを用いて骨を優しく掻き出すことから始めます。メスと骨の間を常に45度の角度に保ち、眼蓋側から球部の正中面側へとメスを動かしてください。

薄層化の工程において、骨に垂直な圧力をかけたり、静脈洞上の骨を傷つけたりしないように注意してください。5分ごとに作業を中断し、水分を含ませたゼラチンスポンジを骨の上に置いて、試料を冷却します。スポンジで頭蓋骨を拭って骨粉や塵を除去し、定期的にメスの先端を拭いて清潔さと鋭利さを維持してください。

海綿骨層または骨梁が見えるまで継続します。嗅球の微細血管が見えたら、骨の掻き出しを止め、11番メスの先端を用いて長方形の領域を描き、嗅球を囲みます。静脈洞の境界内にウィンドウを維持しながら、長方形の領域内で骨の掻き出しを継続します。

硬膜の表面に触れないよう、メスの刃先の深さに十分注意してください。残っている骨の厚さを確認するために、ピンセットの先でそっと押します。圧力をかけて骨がしなるようであれば、次のステップに進んでください。

生理食塩水を1滴加え、メスの先端を水平に向けて骨片を押し上げます。残りの骨を剥離させないよう、ピンセットを用いて慎重に骨片を除去します。嗅球の表面が露出したら、出血や血管がないことを確認します。吻合。

生理食塩水に浸したゼラチンスポンジで患部を拭きます。嗅球を湿潤状態に保つため、29ゲージのシリンジを用いてポリアクリレート歯科用セメントを塗布し、頭蓋窓周囲の骨の上に堤を形成します。硬膜の上に低融点アがロサル（aros）を1滴滴下し、イメージングのために滅菌カバーグラスを頭蓋窓の上に配置します。

脳窓が視野の中心に来るようにステレオ顕微鏡下に定位固定装置を配置し、ピントを合わせて毛細血管を視認させます。580 nmの緑色光に切り替え、画像撮影中の標本の状態を確認するために解剖学的コントロール画像を撮影します。次に、630 nmの照明下での固有光学信号イメージング、または480 nmの照明下でのフラボタンパク質自己蛍光信号イメージングのいずれかを用いて、刺激試験の撮影を行います。標準的なイメージングセッションは、空気のみを供給する5〜10秒間のベースラインで始まり、続いて選択した臭気濃度に応じて3〜10秒間の臭気刺激を行います。

最後に、ベースライン回復のため、70から82秒間の空気送気を記録します。ここでは、頭蓋窓を通じて嗅球の血管系をイメージングし、続いてiOSおよびFASイメージングの両方を用いてキャプチャした、h sinalを嗅気とした刺激試行の結果を示します。iOSイメージングでは、嗅気によって誘発された活性が吸収領域として暗い領域に示されており、ALによって活性化された領域を白い矢印で示しています。また、活性領域は単一の試行および複数試行の平均結果の両方で確認できます。

同じマウスにおいてFASイメージングに切り替えると、誘発活動が黒い矢印で示される白い自家蛍光放出領域として現れ、単一の試行および平均化された複数回の試行の両方で確認できます。iOSイメージングで観察された黒い吸収領域と、FASイメージングで観察された白い自家蛍光放出領域が重複していることに注目してください。この空間的な一致により、これら2つの手法で同一の嗅球糸球体を可視化できることが確認されます。光学反射および自家蛍光信号を用いて誘発活動のマスターイメージングを行う場合、手術に1時間、画像取得に数時間を要します。

これらの光学イメージング手法の主な欠点は、自由に動くマウスにおいて嗅覚マップを可視化する形式で適用できないことです。また、光子が生物組織に浸透できる範囲が限られているため、発生後期の腹側嗅球へのアクセスができず、嗅覚系における固有信号の記録が困難です。光学イメージング分野の研究者が、嗅覚の特殊なコーティングの特性を探索する方法が見出されるかもしれません。

嗅球におけるフラボプロテイン自発蛍光イメージングは、内因性光学信号を用いて嗅球糸球体（OD）の特殊な被覆に関する新たな知見を得るための有望な手法です。