酵母の菌タイプIIIエフェクターの発現により誘導される増殖阻害表現型の同定

このプロトコルを開始するために、目的の細菌エフェクターを発現させるためのベクターを選択します。酵母および酵母株において、このベクターを酵母細胞に形質転換します。次に、エフェクターの発現を誘導します。

誘導された細胞を溶解し、その後のウェスタンブロット分析によってエフェクターの発現を確認します。エフェクターの発現を確認した後、細胞を培養し、10倍段階希釈して抑制培地および誘導培地にスポットします。最終的に、2〜3日後に酵母の増殖を分析します。

こんにちは。テルアビブ大学植物科学科のGuido Cesa博士の研究室に所属しているDo Solomonです。本日は、酵母における細菌タイプIIIエフェクターの発現によって誘導される成長抑制表現型の同定手順について解説します。当研究室では、グラム陰性病原細菌由来のタイプIIIエフェクターの機能を研究するためにこの手順を用いており、エフェクターTIC標的の同定を支援するツールとして活用しています。

それでは、始めていきましょう。目的のタイプ3エフェクターの発現に適した酵母システムを設計する際には、いくつかの重要な要因を検討し、最適化する必要があります。まず1つ目は、エフェクターの発現を駆動させるプロモーターです。

細菌のIII型エフェクターは酵母細胞に対して毒性を持つ可能性があるため、その発現を制御するために誘導性プロモーターを使用する必要があります。本実験では、GAL1プロモーターを使用します。2つ目の要因は、エフェクター遺伝子のコピー数です。

エフェクター遺伝子が2ミクロンプラスミドによって運ばれる場合に、高い発現レベルが得られます。セントロマーを含むプラスミドを使用すると中程度の発現が得られ、相同組換えによってエフェクター遺伝子が酵母ゲノムに組み込まれた場合に低い発現が得られます。検討すべき3つ目の要因は、目的のエフェクターに対する抗体が入手不可能な場合に、タンパク質発現を確認するために使用するエピトープタグです。

一般的に使用されるタグとしては、信頼性の高い市販抗体が存在するM hemagglutinin HAやflagがあります。エフェクタータンパク質の構造や活性への不必要な悪影響を最小限に抑えるため、タグは1コピーのみ使用することを推奨します。最後に、発現に使用する酵母株は、発現ベクターの選択マーカーに対して感受性を持つものである必要があります。

形質転換用に酵母細胞を培養するには、新鮮なプレートから酵母コロニーをピックアップし、15 mLのポリプロピレンチューブに入れた3 mLのYPDに接種してボルテックスします。その後、培養チューブをローラーに短時間置き、30 °Cで定常回転させながら一晩インキュベートします。翌朝、ローラーから培養液を取り出し、室温で800 Gsで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を完全に除き、細胞を1 mLのResus懸濁バッファーで再懸濁し、最大速度で約10秒間ボルテックスミキサーで混合します。形質転換させる各プラスミドおよび追加のコントロール転換用に、細胞懸濁液100 µLをマイクロ遠心チューブに移します。コントロール用チューブを除き、各チューブに一本鎖サーモン精子DNA 5 µLとプラスミドDNA 250〜500 ngを添加します。

次に、各チューブに形質転換溶液を650 µLずつ慎重に加え、ボルテックスします。チューブをローラーにかけ、30 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション完了後、各チューブに70 µLのDMSOを加え、細胞の破壊を防ぐため、チューブを10〜15回転倒混和して混ぜ合わせます。

チューブをボルテックスしないでください。42 °Cに予熱したウォーターバスにチューブを入れ、15分間インキュベートします。15分後、チューブをウォーターバスから取り出し、直ちに氷上で2分間冷却します。

チューブが冷却されたら、遠心分離によって細胞を回収し、ピペッターを用いて粘性のある上澄みを慎重に取り除きます。各ペレットを150 µLの滅菌2回蒸留水で再懸濁し、適切な選択培地を用いたプレート上に細胞懸濁液を塗布します。プレートの蓋を開けたまま2分間放置し、ラミナーフローフード内で乾燥させます。

その後、プレートを30 °Cのインキュベーターに2〜3日間置き、酵母細胞を増殖させます。タンパク質抽出液を調製するために、新鮮なプレートから酵母コロニーを適切な抑制培地3 mLに接種し、ボルテックスで混合します。翌日、培養チューブをローラーに置き、30 °Cで短時間培養します。

培養物をローラーから取り出し、室温で800 Gsで5分間遠心分離し、上清を捨てて細胞ペレットを再懸濁します。3 mLの滅菌DDWに加え、ボルテックスで混合して再度遠心分離し、上清を捨てて細胞を3 mLの滅菌DDWに再懸濁します。次に、細胞懸濁液200 µLを、適切な誘導培地3 mLが入った新しい15 mLチューブに移し、ボルテックスで混合します。

チューブをローラーにセットし、30 °Cで一晩インキュベートし、翌朝に取り出します。培養液1 mL（低密度培養の場合はそれ以上）をマイクロ遠心チューブに移します。室温で800 Gs、5分間の遠心分離により細胞を回収します。ここからの操作は、毒性のあるBeamer capto ethanolの蒸気を吸い込まないよう、ドラフトチャンバー内で行ってください。

ピペッターを用いて上澄みを慎重に取り除き、細胞ペレットを100 µLの氷冷した溶解液で再懸濁します。ボルテックスミキサーで激しく混合し、氷上で30分間インキュベートします。この30分間のインキュベーション中に、100 µLの溶解バッファーのpHを9から10に調整するために必要な希塩酸の量を決定します。

これを行うために、10本の異なるチューブに100 µLの溶解バッファーを入れ、それぞれに異なる量の塩化水素を加えます。適切な量の塩化水素を溶解液に加え、ボルテックスで混合した後、インキュベーション終了時にpH試験紙を用いて溶液のpHを確認します。次に、50 µLの3倍サンプルバッファーを溶解液に加え、ボルテックスで混合します。針でマイクロ遠心チューブの蓋に穴を開け、ヒーティングブロック上で溶解液を5分間沸騰させます。沸騰後、室温で2分間冷却させます。

次に、ライゼート溶液をボルテックスし、10秒間遠心分離します。これで、スポッティングアッセイ用の細胞を調製するための免疫血液分析に使用できるライゼートが完成しました。翌日、前述の方法に従い、各菌株を3 mLずつ培養します。

ロイシン欠損合成完全培地を含むプレートを2枚準備します。一方のプレートの培地には2%glucoseを添加し、もう一方のプレートには2%actoseと1%raffinoseを添加します。これらのプレートを、滅菌済みのラミナーフローフード内で室温で20分間乾燥させます。

細胞を回収し、各細胞ペレットを3 mLの滅菌DDWに再懸濁します。遠心分離ステップを繰り返し、細胞を再度3 mLの滅菌DDWに再懸濁します。各培養液の光学密度（OD）を測定し、OD 600が1となるように1 mLの細胞懸濁液を滅菌マイクロチューブに調製します。

次に、900 µLの滅菌DDWを満たした3本の滅菌マイクロチューブを用いて、各細胞懸濁液から10倍段階希釈を3段階作成します。乾燥させたプレートをグリッド上に配置し、各培養スポットに対し、4つの希釈液を順に10 µLずつ滴下します。スポット後、プレートはフード内で数分間開放したままにします。

スポットが乾燥したら、プレートに蓋をして 30 °C のインキュベーターに 2 〜 3 日間置きます。次に、増殖抑制を検出するための酵母スポットアッセイの結果を示します。ここでは、細菌の III 型エフェクターである AVRPTO hop, AA11 および AVRE1 の発現によって誘導された表現型を示しています。

トマトの病原菌であるPseudomonas syringeのタンパク質を、酵母株においてセントロマー含有プラスミドから発現させ、抑制培地で培養した。A-V-R-P-T-OおよびHOP AA1を発現するプラスミドを保持する酵母株は、空ベクトルを保持する対照株と同様の増殖を示した。AVR E1を保持する酵母は、おそらくGAL1プロモーターのリークおよびAVR E1の高い細胞毒性により、増殖がわずかに低下した。誘導条件下では、AVR E1またはHOP AA1のいずれを発現させても、あらゆる希釈系列においてコロニーが形成されず、激しい増殖抑制表現型が認められた。対照的に、A-V-R-P-T-Oの発現は、増殖抑制効果を全く及ぼさなかった。

酵母における細菌のタイプ3エフェクターの発現によって引き起こされる成長抑制表現型の特定方法について説明しました。この手順を行う際は、発現ベクターと株の両方が結果に劇的な影響を与える可能性があるため、慎重に選択することが重要です。さらに、手順のすべてのステップにおいて、新鮮に形質転換したコロニーを使用することを忘れないでください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。