DNAベースの魚種の識別プロトコル

魚種同定システムは、特定のサンプルに含まれる魚種を同定するための、シンプルで迅速かつ正確なDNAベースの手法です。魚のサンプルにプロテアーゼKで処理し、核酸を溶液中に遊離させます。その後、魚のゲノムDNAを単離し、すべての魚のゲノムに存在する配列に結合するプライマーを用いてPCR増幅を行います。

次に、PCR産物を3種類の異なる制限酵素で消化し、Agilent 2100 バイオアナライザーで分離します。消化反応によって生成されたフラグメント長を用いることで、制限断片長多型（RFLP）パターンマッチングソフトウェアを使用して魚の種を特定できます。こんにちは、Agilent TechnologiesのRachel Formosaです。

本日は、DNAに基づいた魚類の種同定の手順について解説します。この手順はスクリーニング手法であり、新鮮、冷凍、挽き肉、調理済み、乾燥、またはその他の加工が施されたサンプルに含まれる魚類を同定することが可能です。また、このプロセスは1営業日以内に完了させることができます。

この手順は、シーフードの真正性を研究するために用いられます。代替品の混入や誤表示は、経済的、環境的、および食品安全上の重大な結果をもたらす可能性があるため、シーフード業界にとって極めて重要です。さらに、視覚的な識別やその他の伝統的な方法で魚種を特定することは、特に困難な場合があります。魚が加工された後であっても、DNA検査を行うことで、より正確で信頼性の高い結果を得ることができます。

それでは始めていきましょう。DNA抽出のためのサンプル調製を開始し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに、生または調理済みの魚組織サンプルを各個体につき10～1000 mgずつ分注します。そこに、調製したばかりのプロテイナーゼK溶液を220 µL加え、ピペッティングして混合します。

チューブを65 °Cで10分間インキュベートした後、14,000 Gで3〜5分間遠心分離し、未消化の組織をペレット化します。次に、底部の未消化物や上層の油分を避けて、各上清を150 µLずつ新しい1.5 mLチューブに慎重に移します。この上清をゲノムDNA抽出に使用します。

各サンプルに500 µLの核酸結合バッファーを添加し、ゲノムDNA抽出を開始します。これにより、サンプルの総量は650 µLになります。均一になるまでサンプルをボルテックスします。

次に、各サンプルを、キットに付属している2 mLリセプタクルチューブに装着したDNA結合スピンカップに移します。チューブのキャップをスピンカップの上部にパチンと閉めます。14,000 Gsで1分間遠心し、DNAをスピンカップのマトリックスに吸着させます。

遠心分離後、スピンカップを取り出してろ液を廃棄し、カップを再び受容チューブに戻します。1×高塩濃度洗浄バッファーを500 µL加えます。チューブにキャップをし、再度遠心分離を行います。

ろ液を廃棄し、再びスピンカップを受容チューブに戻します。次に、80% ethanolを500 µL加えます。チューブにキャップをし、14,000 Gsで1分間遠心分離します。

3回目の80% ethanolによる洗浄後、エタノール洗浄をさらに2回繰り返し、ろ液を廃棄します。スピンカップを受容チューブに戻し、今度は2分間遠心分離してファイバーマトリックスを乾燥させます。その後、スピンカップを1.5 milliliterの回収チューブに移します。

各スピンカップ内のファイバーマトリックスに直接、100 µLの溶出バッファーを加えます。次に、回収チューブのキャップをスピンカップにとはめ込み、室温で1分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを最大速度で1分間遠心分離します。

次に、スピンカップを廃棄し、チューブにキャップをします。DNA濃度を測定した場合、5 ng/µLから500 ng/µLの範囲となることが予想されます。DNAは4 °Cで最大1か月間保存可能です。長期保存する場合は、DNAを-20 °Cまたは-80 °Cで保存してください。

P-C-R-R-F-L-P試薬キットに含まれるプライマーと試薬を用いてPCRを行います。付属の書面によるプロトコルに従い、PCRの実行中は、ポジティブコントロール、アンチ、およびノーテンプレートコントロールを含む各サンプルを2連（duplicate）で処理することが推奨されます。DTE E one、HAE three、およびNL threeによる制限酵素消化のためのマスターミックスを、以下のコンポーネントを順に混合して調製します：滅菌蒸留水1.5 µL、10x酵素バッファー0.5 µL、および10x酵素0.5 µL。

すべてのサンプル分に反応1回分を加えた十分な量のfourex three試薬混合液を調製します。次に、サンプル名と酵素名を記載した各反応チューブに2.5 µLずつ分注します。PCR終了後、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、氷上に置きます。

各PCR産物を2.5 µLずつ、その反応用の3本の制限酵素消化チューブに加えます。DDEに1本、HAEに3本、そしてNLAに3本です。次に、ボルテックスで混合します。

軽く遠心分離し、消化液を37°Cで2時間インキュベートします。都合が良い場合は、一晩インキュベートすることも可能です。消化後、反応液を65°Cで15分間インキュベートします。

次に、反応を停止させるため、各チューブに60 millimolar EDTAを1 µL加え、ボルテックスします。Agilent bioanalyzer reagent kitを使用し、キットのガイドに従って制限酵素消化液を調製し、A DNA chipのウェルにロードします。各サンプルについて、3種類すべての消化液を同一のチップにロードしてください。

次に、チップをボルテックスし、装置にロードします。ランが終了したら、アッセイコンテキストに移動し、チップサマリータブを選択してください。サンプル名フィールドに、テスト用DNAサンプルの魚種を識別するため、チップの全12ウェルのサンプル名を入力します。

ファイルをクリックしてRFLPデコーダープログラムを起動します。次にXADファイルを開きます。すると、オープンダイアログボックスが表示されます。

次に、使用したDNAチップのXADファイルを選択します。「開く」をクリックすると、チップにロードされたサンプルのリストが表示されます。最初のDNAサンプルに対応する3つのダイジェストを選択してください。

「Enzyme」列に、使用した制限酵素を指定し、「min peak height as percent of lower marker」と表記されたフィールドに値を入力します。デフォルト値は10%です。必要に応じて、見落とされた小さなピークを特定するためにこの値を下げたり、エレクトロフェログラム内の非特異的なノイズによるピークを除外するためにこの値を上げたりすることができます。

最小ピーク高さ（min peak height）の値に調整を加えた後、「reintegrate」をクリックします。次に、ダイアログボックスの下部にある「calc」をクリックします。バイオアナライザーのランから得られたフラグメント長データが、ソフトウェアのフィールドに入力されます。

次に、画面左上のスコアドロップダウンリストからdiceを選択します。魚のサンプルが単一の魚種であるか、あるいは混合物であるかによって、サンプルが混合物である可能性がある場合は、画面下部のcombined score listと表記された表を確認してください。ここでは、3つの消化反応すべての結果に基づいた、最適な種の照合結果が表示されます。

スコアが1の完全一致は緑色でハイライトされます。近似一致は画面上部に黄色でハイライトされます。下限カットオフ値は解析に使用される最小フラグメントサイズを指定し、一致許容値は、フラグメントが予測フラグメントとどれだけ長さが近ければ一致と見なされるかを決定します。

表示されている値はデフォルト設定であり、調整可能です。チップ上の残りのDNAサンプルの解析のために、これらの手順を繰り返します。4種類の異なる魚類種から、このビデオで説明した方法を用いてDNAサンプルを単離、増幅、および消化しました。

Agilent BioanalyzerおよびRFLPデコーダーを用いて解析した、制限酵素消化サンプルのバイオアナライザーゲルをここに示します。ここでは、ソフトウェアによるベンディングパターンを用いて魚種の特定を行っています。1番目のサンプルはマス、2番目はマグロ、3番目は岩魚として正しく識別されています。

そして、最後のサンプルは特定のタラとして特定されました。以上で、Agilent社のPCR-RFLP法を用いたDNAに基づく魚類の種同定の手順をご説明しました。この手法は非常に感度が高いため、本手順を実施する際はサンプルの相互汚染を避けることが重要です。

以上となります。これで、サンプルに含まれる魚類種を迅速かつ簡単、かつ正確に同定する方法を習得したことになります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。