ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

このビデオでは、ゼブラフィッシュ胚を用いて、低分子化合物による線維芽細胞増殖因子（FGF）Ras/MAPK経路の調節を評価するための画像ベースのハイコンテンツスクリーニングを実施します。まず、ブリーディングケージ内でトランスジェニックのオスと野生型のメスのゼブラフィッシュを交配させます。受精卵は底に落下するため、これを回収してペトリ皿に移します。胚を一晩インキュベートした後、96ウェル丸底プレートの各ウェルに配置します。

低分子化合物BCIを添加してFGFシグナリングを過剰に活性化させ、プレートを6時間インキュベートします。それぞれのウェルから共焦点プレートリーダーを用いて画像をキャプチャし、自作のアルゴリズムを用いて解析することで、特定の胚構造における蛍光強度を算出します。こんにちは、私はピッツバーグ大学微生物学・分子遺伝学部のMichael Chang博士の研究室のHiba Kadoです。

ピッツバーグ大学創薬研究所のAndrea Spockです。今日は、化学物質処理のためにゼブラフィッシュ胚を繁殖、選別、およびアレイ化する手順をご紹介します。96ウェルプレートを用いて、線維芽細胞増殖因子（FGF）活性を報告する転移遺伝子組み換え胚を使用し、この経路を過剰活性化させる分子で処理します。

本ビデオでは、ハイコンテンツスクリーニング法を用いて、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚における線維芽細胞増殖因子活性を自動的に取得、解析、および定量化する方法を説明します。この手順では、トランスジェニックゼブラフィッシュとハイスループット化学スクリーニングを活用するためのプラットフォーム技術に焦点を当てます。それでは始めていきましょう。

処置の2日前、ホモ接合体のオス・トランスジェニックゼブラフィッシュを特定し、個別の交配タンクに移します。タンクにセパレーターを設置した後、各タンクに野生型のメスを加え、28 °Cの交配ケージ内で一晩飼育します。翌朝、セパレーターを取り除きます。1時間後、魚を新しいタンクに移し、胚をプラスチック製シブに漉します。

胚をE3溶液が入った100 mmディッシュに移し、28 °Cで6〜8時間インキュベートします。インキュベーション後、実体顕微鏡で胚を観察します。ガス交換期にある胚が実験に適しています。

この時点で、単細胞期のままの未受精卵を除去します。また、不透明または形態異常が見られる生存不可能な胚も除去してください。その後、新鮮なE three溶液を加え、28 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。

翌日、胚を蛍光実体顕微鏡下に置き、発生段階が等しく均一なトランスジェニック胚を選別します。受精後24時間（24 HPF）でGFPを発現している胚は、中脳後脳境界に強いGFP発現が見られ、背側網膜がGFP陽性で眼が十分に形成されています。これらの胚は活発であり、プラスチック製パスチャーピペットを用いて操作すると、卵膜内で動き、身をよじります。

24 HPFの胚を、1匹ずつ96ウェルプレートの個別のウェルに移します。マイクロピペットを使用して、ウェル内の余分なE three溶液を取り除きます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに200 µLのE three溶液を加えます。

次に、1列目と12列目のすべてのウェルに2 µLのDMSOを加えます。続いて、DMSOで調製したBCLを次のように2 µLずつ加えます。2列目と7列目に1 µM、3列目と8列目に5 µM、4列目と9列目に10 µM、そして5列目と10列目に20 µMを加えます。

5列目と10列目にmicromolarを、最後に6列目と11列目に25 micromolarを加えます。次に、プレートをアルミホイルで覆い、28 °Cで6時間インキュベートします。

30 HPFの胚を麻酔するために、各ウェルに10 µLのtricaを添加します。次に、プレートをmolecular devices image express ultra open meta expressソフトウェアにロードします。4x対物レンズと最大ピンホール径の構成を選択してください。

レーザーオートフォーカスを設定してプレート底面を検出し、あらかじめ決定した最適なZオフセットを使用します。関心領域を検出するため、スキャンエリアをビニングなしの2000×2000ピクセルのシングルサイトに設定します。適切なプレートタイプを選択し、励起波長488 nm、蛍光波長525 nmの488 nmアルゴンレーザーを選択します。

次に、ビークル処理した胚が入ったウェルを選択し、「find sample」をクリックします。装置がオートフォーカススキャンを行い、適切な画像取得を確認するために単一の画像を撮影します。ビークル処理したウェルをランダムに選択し、画像を撮影してください。

画像にピントが合っており、頭部でGFP発現が確認できることを確認します。最も明るい領域にカーソルを合わせ、蛍光強度が16ビットカメラの範囲内（65,000ユニット未満）であることを検証します。

これらの手順を、別のビークルコントロールおよびいくつかの化合物処理ウェルで繰り返します。必要に応じて、ポジティブコントロール画像の最も明るい領域が飽和しないように、レーザー出力とゲインを調整してください。次に、「Plate Acquisition and Control」ウィンドウで、「Acquire Plate」を選択してプレートスキャンを開始します。

装置はマイクロプレート全体のウェルごとに1枚の画像を自動的に取得し、SQLサーバーデータベースにアーカイブします。スキャンが完了したら、slingerオプションを有効にしてDeveloperを開き、画像をD definitionのDeveloperにアップロードしてください。

新しいワークスペースを作成します。次に、ファイルメニューから「customized import」を選択します。続いて、画像が保存されているフォルダに移動し、サンプルファイルを開きます。

Molecular Devices社のImageXpress Ultraプラットフォームで生成された画像形式およびファイル構造を認識するインポートフィルターを選択します。次に画像を処理するため、コントロール画像を開き、目的のCognition Network Technology（CNT）アルゴリズムまたはルールセットをロードします。ここで使用するカスタムアルゴリズムは、胚、卵黄、および頭部を自動的に識別し、GFPを発現している頭部構造の輝度と面積を定量化するように設計されています。頭部および卵黄の検出段階まで、ルールセットを実行してください。

卵黄嚢と頭部の適切な割り当てを確実にするため、卵黄が大きすぎるか小さすぎる場合に卵黄検出しきい値を調整するようにルールセットを変更します。次に、明るい頭部構造の検出段階までルールセットを実行します。頭部におけるGFP発現領域を適切に割り当てるため、明るい頭部構造の検出結果が視覚的な観察と一致するまで、頭部構造の検出しきい値を最小強度の倍数として調整するようにルールセットを変更します。

次に、ビークル処理した胚から生成されたランダムに選択した数枚の画像と、PCI処理した胚からの陽性対照画像に対して、ルールセット全体を手動で実行します。すべてのプレート画像にアルゴリズムを適用するには、解析するプレートを選択して「Analyze」を選びます。その後、最適化されたルールセットに移動し、すべてのウェルを解析します。

統合ジョブスケジューラを使用すると、スキャン中に空のウェルや不明瞭な画像が解析から自動的に除外されます。継続的に更新されるキープマップが表示されます。また、実行中にデータと画像の両方にアクセスし、視覚的な確認を行うことができます。

数値データと処理済み画像は自動的に保存されます。すべての画像の解析が完了した後、データはExcel、GraphPad、またはprismなどのサードパーティ製ソフトウェアにエクスポートできます。この図は、CNT解析ありおよびなしの条件下で、vehicle投与群およびBCI投与群で処理されたウェルのアーカイブスキャン画像を示しています。

導入された緑色蛍光タンパク質（GFP）が、形質転換胚の眼、中後脳境界および三叉神経節で検出されています。GFPの強度と発現領域の両方が拡大していることに注目してください。こちらのBCI処理胚では、形質転換胚におけるGFPレポーター遺伝子の発現に対し、BCIの用量依存的な影響が見られます。

最大反応の半分を誘導する濃度（EC 50）は約12 micromolarでした。ここまで、トランスジェニックゼブラフィッシュの胚を交配・採取し、96ウェルプレートに配置する方法について解説しました。シグナル伝達経路の活性化剤として、PCIの濃度を段階的に上げて添加しました。

また、形質転換胚のイメージングを自動化する方法を示し、認知ネットワーク技術に基づく独自に設計したアルゴリズムを用いて画像を解析しました。このアプローチにより、線維芽細胞増殖因子シグナリングの低分子活性化剤の効果を、段階的に定量測定することができました。この手順を行う際は、個体間のばらつきを最小限に抑えるために、胚を慎重に選択することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。