大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

本実験の全体的な目的は、胚発生および生理学的機能の重要な側面を特異的に調節する低分子化合物を探索することです。これは、まず多数の受精卵を96ウェルプレートに配置し、次にスクリーニングを行うことで達成されます。低分子化合物ライブラリーの分注液を、プレート内の胚に添加します。

ウェルプレートを用いて、低分子化合物によって誘発された表現型を検討します。これにより、どの低分子化合物がスーパーフィッシュの発達または生理機能に特異的に影響を与えるかという結果が得られます。こんにちは、ヴァンダービルト大学医学部のチャールズ・ホンです。

当研究室では、ゼブラフィッシュの胚を用いてハイスループット化学スクリーニングを行っています。これは比較的容易な手法であり、新規の生理活性化合物を探索するために幅広く応用することが可能です。化学スクリーニング実施日の前日の午後に、10〜20個のゼブラフィッシュ繁殖水槽を準備します。

各水槽に仕切り板を設置し、魚用ネットを用いて養殖システムから水を取り込み、各水槽を満たします。その後、成体オス1匹と成体メス1〜2匹を内部容器に入れます。繁殖に使用する各水槽にラベルを貼り、スクリーニングの朝に蓋をします。繁殖水槽から仕切り板を取り除き、ゼブラフィッシュを交配させます。

その後1時間かけて、受精卵が各内部容器の底にあるグリッドから落下するようにします。1時間後、成魚のゼブラフィッシュを恒久的な保管タンクに戻します。

内部容器を取り出し、各繁殖タンクの水をプラスチック製ティーストレーナーで濾して卵を回収します。ストレーナーをペトリ皿の上で逆さまにし、静かにすすいで卵をペトリ皿の中に流し込みます。E three mediumが入った洗浄ボトルを使用して、不透明に見える未受精卵をすべて取り除きます。

使い捨てプラスチックピペットを使用し、各交配から約200個の胚を得ます。次に、ガラスパスツールピペットを用いて、E3培地中の胚約5個を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。これで、胚が96ウェルプレートに配置されました。

12チャンネルピペットを使用して、ウェルからE three培地を可能な限り除去します。その際、胚を傷つけないように注意してください。次に、12チャンネルピペットを用いて、E threeを250 µL分注します。

胚が乾燥しないよう、可能な限り迅速に、0.5 µg/mLのカナマイシンを含む培地を各ウェルに加えます。化合物を添加する目的の段階に達するまで、96ウェルプレートを28.5 °Cのインキュベーターに入れます。本プロトコルでは、初期胚のパターン形成を乱す化合物を探索するため、胚を3時間、または胚の90%以上が1000細胞期に達するまでインキュベートします。低分子化合物ライブラリーは通常、提供されています。

各化合物が10 millimolarのストックとしてDMSOに保存されている96ウェルソースプレートを用意し、胚が目的の段階に達する約60分前に、小分子の分注分を含む適切な数の96ウェルプレートを解凍します。プレートへの結露を最小限に抑えるため、ソースプレートのシリアル番号またはその他の識別番号を記録してください。乾燥剤を入れたデシケーター内で静置します。

マルチウェルプレート用アダプターを備えた卓上遠心機で、プレートを短時間遠心します。12チャンネルピペットを用いて、ソースプレートからアルミシールを剥がします。ソースプレート内の化合物をDMSOで目的の濃度まで希釈します。本プロトコルでは、最終濃度を0.5 millimolarとし、10 millimolarのストックプレートに4.75 µLのDMSOを加えて希釈します。

96ウェルプレート内の胚が目的の段階に達したら、12チャンネルピペットを使用して、ソースプレートから胚を含むレシピエントプレートへ化合物を2.5 µL分転移させます。胚と化合物が入ったプレートに蓋をし、胚プレートにソースプレートの識別番号を記録します。プレートを軽く回して混ぜ合わせ、28.5 °Cのインキュベーターに入れます。

未使用の低分子化合物を含む各ソースプレートをアルミ箔で覆い、テープで固定して、長期保存のために-80 °Cのフリーザーに保管します。視覚的スクリーニングを実施する前に、具体的なヒット基準を策定します。例えば、脳の発達における低分子阻害剤のスクリーニングでは、前脳の消失をもたらす化合物ヒットとして定義することができます。

眼の欠損は前脳喪失の容易な視覚的指標であり、発生の任意のタイミングで評価する際に蛍光を用いる必要がありません。化合物を処理した胚を含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、実体顕微鏡下で各ウェルを観察します。前脳発生の低分子阻害剤をスクリーニングする場合、前脳発生阻害のマーカーとして眼の欠損を確認するため、28時間後にプレートを観察してください。5個中3個以上の胚に規定の表現型が見られたウェルについて、プレートの識別番号とウェルの位置を記録します。その後、96ウェルプレートをインキュベーターに戻します。

48時間後に、眼および前脳の消失を再確認します。胚に前脳は形成されませんが、少なくとも4日間は生存します。化合物を複数の用量で再試験し、ヒットの可能性を再確認します。各用量について、48ウェルプレートを用いて、0.5 mLのE3培地内で10個の胚をテストします。

再試験のための化合物の調製タイミングは、初回スクリーニング時と同一にする必要があります。化合物の再試験において、得られた表現型が用量依存的に再現された場合に、HIITであると確定します。最後に、化学ライブラリーの小分子データベースから、当該のhi化合物を特定します。

ゼブラフィッシュを用いた視覚的化学スクリーニングにより、体軸への影響に基づいた低分子ヘッジホッグシグナル阻害剤を発見しました。この画像は、ヘッジホッグ阻害剤に曝露され、尾部の顕著な腹側湾曲を示している胚を示しています。24時間後に観察したこれらの胚を48時間後に再確認したところ、依然として腹側湾曲の表現型を示していました。

この画像は、化合物を処理した胚とヘッジホッグ経路変異体胚を比較したものです。この手法を習得すれば、1人で週に約400種類の化合物を、わずか数時間でスクリーニングすることが可能です。また、この手法により、化学生物学者が細胞分化、細胞シグナル伝達経路、および胚発生などを研究する道が開かれました。

未同定の低分子化合物を扱う際は、これらの分子が潜在的に有害である可能性があるため、白衣と手袋などの適切な安全装備を着用することが重要です。