ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

本プロトコルでは、ビデオイメージング用カメラを搭載したicon bio station CTインキュベーターで収集されたタイムラプスビデオを解析し、ヒト胚性幹細胞コロニーの増殖を測定するビデオバイオインフォマティクス法について解説します。ヒト胚性幹細胞（HESC）コロニーをコンフルエンシー70%まで培養して再播種し、48時間インキュベートした後、Biot ctを用いてさらに48時間、HESCコロニーを撮影します。増殖率は、CL quantソフトウェアで開発されたセグメンテーション強調および測定レシピを用いて決定します。

これらのレシピは、各コロニーに対して精密な手動マスクフィッティングが可能な画像解析ツールであるAdobe Photoshopとの比較によって検証されています。ビデオバイオインフォマティクスという新興分野を利用することで、顕微鏡ビデオからの生物学的データの処理、解析、およびマイニングを自動化することが可能です。こんにちは、カリフォルニア大学リバーサイド校の細胞生物学および神経科学科、Prou Talbot博士の研究室のSerena Linです。

こんにちは。Talbot LabのSean Finoです。こんにちは。細胞分子・発生生物学大学院プログラムのTI Satishです。本日は、ビデオバイオインフォマティクスツールを用いてヒト胚性幹細胞コロニーの成長を測定する方法について解説します。

当研究室では、環境毒性物質がヒト胚性幹細胞の挙動に及ぼす影響を測定するためにこの手順を用いています。今回は、新設された幹細胞コアファシリティにてこの手順を実演します。それでは、始めていきましょう。

ビデオ解析用にHESCを準備するには、HESCをMatrigelコートした6ウェルプレートでコンフルエンシーが70%になるまで培養します。HESCを含む1つのウェルから培地を吸引し、1 mLのPBSで2回洗浄します。1 mLのAccutaneを加え、37 °C、5% CO2条件下で1分間インキュベートします。次に、ウェルに10〜12個のガラスビーズを加え、コロニーが完全に剥離するまでプレートを穏やかに振盪します。

1 mLのヒト胚性幹細胞維持培地またはマウス胚性線維芽細胞馴化培地を用いてAccutaneを中和します。ビーズを含まない剥離細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、200 Gで3分間遠心分離します。上清を捨て、500 µLの新鮮なヒト胚性幹細胞維持培地またはM-T-E-S-Rでペレットを再懸濁します。HESC懸濁液100 µLを、Matrigelでコーティングした12ウェルプレートの各ウェルに滴下します。

プレートをゆっくりと前後に揺らし、光学顕微鏡下で培養細胞を観察して、細胞塊がウェル全体に均等に分布していることを確認します。プレートを37°C、5% CO₂のインキュベーターに48時間置き、細胞が平らに接着し、容易に視認できる大きさになるようにします。48時間後、培地を吸引し、500 µLのPBSでウェルを洗浄して未接着細胞を除去した後、各ウェルに500 µLのM-T-E-S-R培地を加えます。

直ちにプレートをBiot CTに設置し、タイムラプス画像の撮影を開始します。他のコロニーに接触して成長する可能性が低い、独立した単一コロニーのある視野を選択するようにしてください。本プロトコルでは、7分間隔でフレームを撮影し、さらに48時間にわたって細胞をビデオ記録します。

セグメンテーションレシピを作成するために、まずビデオ全体を手動でスキャンし、録画期間中ずっとフォーカスが合った単一のコロニーが含まれていることを確認します。その後、CL quantsソフトウェアのセグメンテーションウィザードを開き、Nextボタンをクリックします。正しいイメージチャンネルを選択し、Nextボタンをクリックします。

「soft matching」を選択し、「Next」をクリックします。コロニーの外縁から中心領域に向かって円を描くようにし、1つまたは2つの関心領域（want regions）を選択します。この領域は可能な限り小さく、かつコロニー全体を代表するものである必要があります。

領域を多く選びすぎると、マスクの適用が不正確になる可能性があるため注意してください。「次へ」ボタンをクリックします。コロニーの一部ではなく、かつ背景の一部でもない領域を囲み、「領域として除外」を選択してください。

これらの領域には、デブリや死細胞など、抑制すべきパターンが含まれています。「次へ」をクリックしてください。コロニー、デブリ、または死細胞ではない領域を囲んで、背景を選択します。

背景は均一で、すべてのフレームに現れる可能性が高いものである必要があります。通常は、コロニー周囲のグレーの背景を選択します。「次へ」ボタンをクリックしてください。

マスクが関心領域を正確にカバーしていない場合は、関心領域の上にカラーマスクが表示されます。マスクの変更が必要な場合は、画面右下のセグメンテーションしきい値範囲を増減させてください。「updates soft matching regions」を選択します。

これにより、「想要（want）」、「不要（don't want）」、または背景領域を変更できます。マスクに問題がなければ、「apply threshold（しきい値を適用）」を選択し、「save my mask（マスクを保存）」をクリックします。その後、「next」ボタンをクリックしてください。

すると、マスクが別の色で表示されます。「finish」を選択してください。ソフトウェアの右上に、セグメンテーションレシピとしてレシピが表示されるはずです。

必要に応じて、右クリックして新しい名前を入力し、レシピの名前を変更してください。レシピを適用するには、右クリックしてマウスを重ねます。

レシピを適用します。使用するフレーム数を選択するメニューが表示されます。マスクの忠実度を確保するため、フレーム間隔を20フレームごとに設定してください。

マスクを適用したフレームの10%をランダムに手動でスポットチェックし、デブリ内の不要な領域を除去するためのエンハンスメントレシピを作成します。エンハンスメントレシピフォルダを右クリックし、「新規作成」をクリックします。元の視野から新しいエンハンスメントレシピが表示されます。

ツールバーのアイコンにマウスを合わせ、画像の右側にあるエンハンスメントモジュール切り替えボタンを確認してクリックします。ラベル付けのドロップダウンメニューを選択し、「connected」のラベル付けを選択し、続いて「connected two」のラベル付けを選択します。

新しいタスクバーが表示されます。セグメンテーションレシピから初期マスクを取得し、入力ボックスにドラッグします。これにより、バーに入力マスク番号が表示されます。

入力マスク番号のアイコンをマスク0のアイコンまでドラッグします。タスクバーで最小サイズ（min size）を確認し、関心領域のみが表示されるまで数値を調整してください。各フィッティング試行ごとに、必ず「execute」をクリックしてください。

最小サイズの調整に満足したら、画面下の前の増感レシピをクリックし、レシピに保存を選択します。ソフトウェアから選択したレシピを上書きするかどうかを確認されるので、「はい」を選択します。スポットチェックのセグメンテーションと同様の手順で、増感レシピを確認してください。

セグメンテーションおよび強調処理のレシピに満足した場合は、続いて測定テンプレートの作成に進みます。まず、右側のツールバーから「create measurement template（測定テンプレートの作成）」を選択します。測定ウィンドウ内で、「move cursor（カーソルの移動）」を選択し、クリップアートの細胞図の上に配置します。

Ctrlキーを押しながら「morphology」セクションの下にあるセルを選択し、「default parameter」のチェックを外して「area parameter」にチェックを入れます。その後、テンプレートウィンドウを閉じます。アイコンを選択してください。

測定レシピを作成します。レシピの名前を変更します。「テンプレート」タブに移動し、それを選択します。右上のコーナーから、 previously 作成した測定テンプレートを測定ウィンドウにドラッグ＆ドロップします。

測定レシピウィンドウで「はい」をクリックして続行し、チャンネルマッピングを選択します。次に、全細胞選択マスクマッピングを選択します。続いて、全細胞オプションを選択します。拡張マスクを使用する場合は、レシピタブの下にある測定レシピを選択してください。

メインウィンドウで、測定レシピウィンドウ内の保存アイコンを選択します。その後、ウィンドウを閉じます。次に、視野を閉じてから再度開きます。レシピリストフォルダを右クリックして「新規」をクリックし、必要な適用順にレシピをレシピリストにドラッグして、「レシピリストをロック」を選択し、Adobe Photoshopを用いてビデオデータにレシピを順次実行します。

同一コロニーの20フレームごとに解析を行いました。Adobe Photoshopでコロニー画像のフレームを手動で開きます。ツールバーの自動選択ツールをクリックします。

コロニー周辺の領域をクリックし、コロニー領域以外の視野全体がカバーされるようにします。コロニーを囲む点線が、コロニーの内部ではなく、その外周にちょうどフィットしていることを確認してください。点線が外周に沿っていない場合は、上部ツールバーの許容値（tolerance value）を適宜変更してください。

ツールバーのクイックマスクモードにある「edit」をクリックし、コロニーをクリックして選択します。「window」のプルダウンメニューに移動し、「histogram」をクリックします。キャッシュは1に設定してください。

キャッシュが2である場合は、感嘆符の式マークをクリックしてキャッシュを1に変更します。ピクセル値をスプレッドシートに記録してください。以上の工程を20フレームごとに繰り返します。

PhotoshopおよびCL quantソフトウェアを用いて収集したデータを、まとめてプロットすることが可能です。HESCコロニー増殖を定量化する本プロトコルは、生物学的な課題に対するビデオバイオインフォマティクスの応用例の一つを示しています。ここでは、CL quantソフトウェアとAdobe Photoshopを用いて算出した、48時間におけるコロニーサイズの増加を比較したグラフを示します。

グラフは、2つのソフトウェアパッケージでそれぞれ解析した5つの異なるコロニーを示しています。各コロニーは異なる色で表されています。実線はsail quantソフトウェアを用いて導出され、点線はPhotoshopを用いて収集されました。

生データのグラフから、コロニーの初期サイズが異なるという事実を考慮しても、両方の測定方法が良好に一致していることがわかります。この図は、コロニーサイズの増加率（％）として再プロットしたデータを示しています。増殖率は初期のコロニーサイズに関わらず同様であり、どちらの分析手法でも同様の結果が得られています。

以下のグラフは、HESCコロニー増殖に関する前述のパーセント変化データの平均値を示しています。このグラフから、ビデオバイオインフォマティクスを用いて行われた解析とAdobe Photoshopを用いて行われた解析の間で、良好な一致が見られることが明確に分かります。以上で、ビデオバイオインフォマティクスツールを用いてヒト胚性幹細胞コロニーの増殖を測定する方法について説明しました。

位相差顕微鏡を用いてこの手順を行う際は、ソフトウェアによる正確なコロニー選択のため、コロニー周囲のハロー（光輪）を必ず含めるようにしてください。また、本プロトコルで示した方法以外に、培養、インキュベーション、およびビデオ収集のための他の手法を代用できることも重要です。レシピが開発および検証されれば、手動分析よりもはるかに迅速に、かつ実験的なばらつきを抑えて分析を行うことが可能になります。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。