実験的転移アッセイ

本実験の全体的な目的は、尾静脈注入によりヒトがん細胞の転移能を検証することです。まず、免疫不全マウスへの注入に向けて細胞を調製します。その後、細胞を免疫不全マウスに注入し、1〜2ヶ月後に肺転移を誘導させます。

マウスを解剖し、肺転移の定量および培養を行います。この種のアッセイの結果は、特定の種類のがん細胞の転移の程度を示します。こんにちは、ロチェスター大学生物医学遺伝学科のDr.LEの研究室のSonali Mohantyです。

本日は、実験的転移アッセイを行う手順について解説します。当研究室では、がんの転移を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。

細胞のコンフルエンシーが約70%に達した状態で開始します。プレートから培地を吸引し、1xPBSで穏やかに1回洗浄します。次に、0.05% Trypsinを2 mL加え、反転させます。プレートを穏やかに揺らし、細胞の剥離を促進させます。

顕微鏡下で細胞が剥離する様子を観察します。トリプシンの活性を停止させるために、FBSを含む培地を十分な量加えます。その後、50 milliliterチューブに移します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。濃度が決定したら、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、約200 ×gで3分間遠心分離します。培地を慎重に取り除き、最終濃度が約5 × 10⁶ cells/mLになるよう、適切な量のハンクス平衡塩溶液（HBSS）を加えて再懸濁します。

次に、Falcon社の70 µmセルストレーナーでろ過します。大きな細胞凝集塊を除去するため、5 mL培養チューブの上に置いたフィルターにピペットのチップを直接当てます。懸濁液をフィルターを通してチューブ内へ迅速に排出してください。

トリパンブルーを用いて再度細胞数をカウントし、生存率を判定します。注入前の生存率は90%以上である必要があります。その後、最終濃度が2.5 × 10⁶ cells/mLになるように希釈します。

氷上で保持します。免疫不全マウスの尾をそっと掴み、背中がスリットに接するようにしてマウス拘束器に入れ、尾が背面にある小さな開口部から出るようにします。リングをスリットに沿ってゆっくりと内側にスライドさせます。

リングがマウスの口に固定されたら、そのままロックします。マウスが自由に動けないようにしますが、呼吸速度は正常である必要があります。次に、尾静脈の主要な部位を確認します。

マウスの尾には4本の主要な血管が存在します。動脈は尾の背面および腹側に位置しています。静脈は外側に位置しています。

準備した細胞を1 mLシリンジに200 µL以上吸い取ります。30Gのハーフニードルを取り付け、気泡を押し出します。シリンジ内の最終容量を200 µLにします。

尾の遠位端に注射する準備をします。これにより、1回目の試行に失敗した場合、2回目の試行に尾のより近位の領域を使用することができます。注射部位を70%ethanolで拭いた後、尾を真っ直ぐに引っ張ります。

親指でチップを持ち、人差し指で注入部位を支えます。針を静脈に刺入し、細胞を注入します。注入中は、針とシリンジが静脈と平行であることを確認してください。

そうしないと、針が血管壁を突き抜け、細胞が隣接する尾組織に注入されてしまいます。手技が成功した場合は、針を抜いてください。注入部位から血液が浸出しているはずです。

清潔な脱脂綿で軽く押さえてフロス操作を容易にし、尾を上方に向かって触診して、残ったサンプルを循環系に押し出します。マウスを拘束具から放し、ケージに戻します。注射の試行回数と注入した細胞数をラボノートに記録します。

注入後の細胞生存率を測定します。前述の通り、このステップは注入プロセス全体を通じて細胞が生きていられることを確認するためのものです。注入実験の終了時に細胞生存率は低下しますが、80%以上を維持している必要があります。オプションのステップとして、残った細胞を遠心分離し、ペレットをPBSで1回洗浄してください。

その後、ウェスタンブロッティングなどの今後の解析のために、ペレットを-80 °Cで凍結保存します。ノックダウンによる遺伝子発現を確認するため、1〜2か月後にマウスを解剖し、転移部位を特定します。まず、安楽死させたマウスを解剖台に置くことから始めてください。

マウスにエタノールを十分にスプレーします。胸郭を切開して肺と心臓を露出させます。その後、それらを慎重に摘出し、PBSに入れます。

肺は、細胞が最初に到達する毛細血管床を有しているため、転移の主要な部位となります。細胞が血流に入った後、心臓を取り除き、肺をPBSで洗浄して、解剖顕微鏡下で肺の各葉を観察します。肺の両側で検出可能な転移数を数え、その後、4つの肺葉すべての転移数を合計して、肺転移の総数を決定します。

次に、ハサミを用いて個々の肺転移巣を切り出し、分離します。それぞれの転移巣を70 µmのセルストレーナーに移し、滅菌したニードルキャップの先端を用いて細かく砕きます。セルストレーナーを数 mLの培地で洗浄し、フィルターを通過した細胞を回収します。

培養皿を用い、各皿に1つの転移巣からの細胞を分注します。細胞を37 °Cで少なくとも4日間、刺激を与えずにインキュベートします。当初はがん細胞と線維芽細胞の両方がプレート上で増殖しますが、徐々に線維芽細胞が死滅し、がん細胞に置き換わります。

がん細胞が薬剤耐性遺伝子を保持している場合は、対応する抗生物質を用いて細胞を選択します。3日後、PBSで皿上の血液や組織の残渣を洗浄し、新鮮な培地を加えます。誘導された細胞の純度は、ヒト特異的タンパク質に対する抗体を用いた免疫染色によって評価します。ここでは、薬剤選択を行わない場合でも、抗ヒト抗体を使用します。細胞の99%以上がヒト由来である必要があります。

新たに誘導された細胞を免疫不全マウスに再び注入し、本アッセイの最後に転移能を試験することができます。一般的に、転移能の高いがん細胞株は多くの肺転移を引き起こしますが、転移能の低いがん細胞株からの肺転移はごくわずかです。これらの画像は、ヒトメラノーマ細胞株を注入してから2ヶ月後の肺転移を示しています。

3 7 5 sm。この方法を用いて誘導された細胞は、通常、親株と比較して試験時に多くの転移を引き起こします。以上の通り、このアッセイを用いて、実験的転移アッセイを実施する手順について説明しました。

この手順を行う際は、細胞を尾静脈に注入し、周囲の組織や尾の組織に注入しないようにすることが非常に重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。