実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

本手順の全体的な目的は、腫瘍特異的T細胞養子移送免疫療法のin vivoにおける有効性を検証することです。まず、マウスの側尾静脈に腫瘍細胞を注入して移植し、肺転移を成立させます。次に、腫瘍を担持したマウスに対して、腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTLs）を用いて治療を行います。

最終ステップは、腫瘍結節を可視化および定量化するための手段としてインディアインクを使用することです。最終的に、腫瘍サイズの測定と腫瘍結節数の定量化を通じて、さまざまな治療法のCIEを示す結果を得ることができます。こんにちは、私はMary Zimmermanです。ジョージア医科大学のDr. Kevin Luの研究室に所属しています。

こんにちは、シェリーン・フーです。私は大学院2年次生で、ルー博士の研究室に所属しています。生存曲線などの従来の手法と比較したこの技術の主な利点は、この手順が定性と定量の両面から解析可能であることです。この技術の意義は、ヒトのがん患者におけるT細胞養子免疫療法を模倣しているため、がん治療へと応用できる可能性があります。

それでは開始しましょう。腫瘍細胞を注入する前日に、10%血清を含む10 mLのRPMI培地を用いて、1×10⁷個のCMS4met細胞をT75フラスコに播種します。増殖速度の速い腫瘍細胞を得るため、注入当日まで37°Cで一晩インキュベートします。

培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄した後、37°Cで5分間、0.05%trypsin EDTAを用いて腫瘍細胞を回収します。10%血清含有RPMI培地10 mLを加えて反応を停止させます。その後、細胞をコニカルチューブに移します。

Val Legend RT遠心機を用い、1300 RPMで3分間細胞を遠心分離します。室温にて上清を除去し、洗浄のため細胞を10 mLの新鮮な1 XHB Ssに再懸濁します。その後、同様の手順で再度遠心分離し、再懸濁します。

hemo.Cytometerを用いて腫瘍細胞数をカウントします。HBSSで細胞を希釈し、1回あたりの注入に必要な細胞数を再懸濁します。合計100 µLの溶液をビーカーに入れ、温水に浸して加温し、6〜8週齢のB SEAマウスに投与します。

尾静脈を拡張させるため、マウスをベンチ上の尾静脈用拘束具に固定します。マイクロシリンジを用いて、100 µLの腫瘍細胞を尾静脈の外側に注入します。注入後の感染を防ぐため、無菌操作を行ってください。

出血が止まるまで、注入部位を軽く圧迫します。マウスをケージに戻し、腫瘍が目的の段階まで成長するまで待ちます。移植当日、ピペッティングにより、調製済みの精製細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を再懸濁します。

本文の記載に従い、すべての細胞を1枚のプレートから15 milliliterのコニカルチューブに移します。このとき、液量がチューブの3分の2を超えないようにしてください。滅菌済みのパステールピペットをコニカルチューブに差し込み、全量が14 milliliterに近づくまで、リンパ球分離培地（LSM）を細胞の上に層状に加えます。

層を乱さないように注意してください。室温で2000 RPMで20分間遠心分離します。回転後のローターの減速にブレーキを使用せず、CTLを新しい15 milliliterコニカルチューブに移します。

HBSSを約10 mL加えます。洗浄するため、室温で1300 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収します。その後、注入に必要な細胞密度になるようHBSSで再懸濁します。

1回あたりの注入総量を100 µLに維持します。本ビデオの前の段階で示したものと同じ尾静脈注射の手法を用いてください。CTLを腫瘍担持マウスに注入した後、マウスをケージに戻し、CTLを腫瘍に作用させます。

通常、CTL投与の14日から21日後にマウスを犠牲にして解析を行います。肺転移を可視化するためには、犠牲にしたマウスをスタイロフォームボードの上に仰向けに置きます。気管へのアクセスを妨げないよう、脚をピンで固定してください。

腹部の中央から、腹面を70% ethanolでスプレーします。はさみを用いて、正中線に沿って肋骨を通り、唾液腺に向かって切開します。気管を露出させます。

ピンセットを使用して、気管周囲の組織を除去します。片手で200 µLピペットチップを持ち、気管の下に差し込みます。気管をゆっくりと持ち上げ、体から離します。

プラットフォームを180度回転させます。50 milliliterのシリンジを使用して、気管から肺にインディアインクを注入します。強い抵抗を感じるまで、インクで肺を完全に膨らませてください。

ハサミで気管を切断します。ピンセットを肺の下に滑り込ませ、マウスから肺を取り出します。化学薬品用フード内で、1 Lの水が入ったビーカーを用いて肺を軽く洗浄します。

肺を5 mLのFTI溶液が入ったガラス製容器に移します。腫瘍組織は、黒い肺上の白い結節として現れます。数分後、腫瘍の計数が可能になり、その後はFTI溶液内で無期限に保存することができます。

乳癌を転移させたマウスの肺。細胞株4T1では、腫瘍を示す白いスポットが見られる。IRF8ドミナントネガティブ変異体K79Eを導入したマウスでは、腫瘍細胞の転移能の亢進が認められる。

これらの画像は、CTL養育移入免疫療法の有効性に関する組織学的解析を示しています。生理食塩水を注入した腫瘍担持マウスでは、6日後に矢印で示される複数の腫瘍が認められました。一方、腫瘍特異的T細胞を注入したマウスでは、同様の実験において腫瘍の減少が認められました。

インディアインク処理により、CTL養子移入の有効性をより簡便に測定することが可能です。ここでは、腫瘍担持肺上の白い腫瘍結節により、CTL養子移入が成功した肺との明確な区別が可能となり、結節数をカウントすることで、組織学的解析では不可能な程度の定量化が行えます。この手順を実施する際は、尾静脈注入をより容易かつ正確に行うため、マウスを温めておくことが重要です。

このビデオを視聴することで、腫瘍の大きさおよび数を定量化するこの簡便な手順を通じて、治療の有効性を評価する方法を十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。