生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

本手順の目的は、胚上皮細胞の形態を解析するためのライブイメージングおよび簡便な定量化方法を提示することです。まず、すべての器具と装置を準備します。次に、カエル胚からX explanを切り出し、長期培養用のチャンバーに収容します。

手順の3番目のステップは、上皮細胞の高解像度画像をリアルタイムで収集することです。手順の最終ステップは、Image Jを用いて上皮細胞の形態学的詳細を定量化することです。最終的に、高解像度共焦点顕微鏡を通じて、追跡された細胞領域と膜強度が示される結果を得ることができます。こんにちは、ピッツバーグ大学バイオエンジニアリング学科のDavidson研究室のSagar Joshiです。

本日は、Xenos lavia 胚上皮細胞のライブセルイメージングおよび定量的解析の手順を解説します。この手順を用いて、細胞骨格のリアルタイムな変化を研究します。それでは、始めていきましょう。

動物キャップを培養するためのチャンバーを準備するには、シリコングリスを使用して、カスタムアクリルチャンバーまたは小型のナイロンワッシャーを45×50 mmの大型カバーガラスに密閉します。チャンバーに1% BSAを含む1/3 XMBS溶液を1 mL加えます。小型のカバースリップ片を同溶液でコーティングし、室温で2〜4時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。

X explanのガラスへの付着を軽減するため、チャンバーをDFA培地で洗浄し、満たします。xsを移す直前に、カバースリップの破片を同様の方法で洗浄します。次に、目的のmRNAを1〜4細胞期にマイクロインジェクションし、1/3 XMBS中で目的の段階まで成長させたDFA培養胚のディッシュに、それらを浸します。解剖用実体顕微鏡下で、先端を斜めにカットした転送ピペットを用いて、胚をDFAのディッシュに移します。

ピンセットを用いて胚を固定し、動物極外胚葉（CapEx）を切り出します。ヘアループを使用して胚を一定の位置に保持してください。ヘアナイフを用いて、動物極に小さな切開を加えます。

滑らかなフリックカットを繰り返して切開線を伸ばし、キャップ外胚葉を除去します。同様の方法で3〜4個の外胚葉（explant）を摘出します。その後、転送ピペットを用いて、準備した培養チャンバーに移動させてください。

ヘアループを用いて、上皮がチャンバーの底部を向くように各X explanを配置します。ピンセットを使用して、カバーガラスの破片の中央を保持してください。

端部分にシリコングリスを塗布します。各X explanの上に断片を1つずつ配置します。少量のシリコングリスを点付けし、各断片を軽く固定します。

X explanを過度な力で完全に押し潰さないように注意しながら操作します。チャンバーにDFAを満たし、チャンバーの上端にシリコングリースを塗布します。その後、24 x 40 millimeterのカバーガラスで上部を密封します。

チャンバー内のDFAのレベルを調整して気泡を減らし、あふれた分はティッシュで吸い取ります。これでX植物を密閉チャンバー内で室温で1日間、長期培養することができます。共焦点顕微鏡の20倍対物レンズをセットします。X説明図を含むチャンバーを顕微鏡のステージ上に配置し、明視野下で位置を固定するために、チャンバーの上に小さなバランスウェイトを置きます。

フォーカスを調整し、コースポジショニングを用いて表層細胞の頂端端を可視化します。蛍光観察に切り替え、より高倍率の対物レンズを使用します。剥離上皮の単一画像またはタイムラプス動画を収集する場合、最適な画像が得られるように取得設定を調整してください。

チューニングおよびイメージングに関するヒントについては、本プロトコルの記述部分を参照してください。レーザー出力は可能な限り低く維持します。xの表皮の画像またはタイムラプス動画を撮影します。

データ収集に関する提案については、プロトコルの記述部分を参照してください。共焦点顕微鏡の画像ファイルからは、さまざまな方法でデータを抽出できます。ここでは、Bio-Formatsプラグインを導入したImage J解析ソフトウェアを用いてデータファイルを分析する2つの例を紹介します。

上皮細胞の細胞面積を測定するには、「Analyze」メニューを開き、「Set Measurements」をクリックします。ツールバーから選択ツールを選び、細胞の輪郭を囲みます。「Analyze」メニューから「Tools」を選択し、「ROI Manager」をクリックします。関心領域（ROI）マネージャーを開くには、Control + T キーを押してください。

ROIマネージャーにアウトラインを追加するには、画像から任意のアウトラインを選択して追加します。次に、「save」をクリックしてROIセットをROIマネージャーに保存します。「measure」をクリックしてください。

結果ウィンドウに、各ROIの測定面積が表示されます。細胞膜の強度を測定するには、ImageJツールバーから直線ツールを選択します。膜に対して垂直に線を引きます。

前の例と同様にCTRL Tを押します。選択範囲をROIマネージャーに追加するには、「Analyze」メニューを展開し、「Plot Profile」をクリックして、ライン上の相対強度のプロットを生成します。グラフを画像として保存するには、新しく表示されたプロットウィンドウの「Save」をクリックします。

リストメニューから「ファイル」を選択し、「名前を付けて保存」してください。以上で、摘出した動物のCapEx外植片から胚性上皮細胞をライブイメージングし、定量化する方法について説明しました。この手順を行う際は、DFAに抗生物質と抗真菌剤を添加することを忘れないでください。細菌や真菌の増殖を防ぐため、カバーガラスで外植片を押さえる際は細心の注意を払ってください。必要以上の圧力をかけると、外植片を潰してしまう可能性があります。

また、最高の品質の画像データを得るためには、共焦点顕微鏡に最適な設定を施すことが重要であることも忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。