鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

本手順の全般的な目的は、ニワトリの体節または神経管の単一細胞に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを注入することです。まず、適切な先端開口径を持つマイクロインジェクションピペットをプル（抽出）することでこれを達成します。手順の第2ステップでは、注入用のプラスミドストックを調製します。

本手順の第3ステップは、注入用の胚を準備することです。第4ステップでは、マイクロピペットにプラスミドDNAを充填します。そして最終ステップで、目的の組織に注入を行います。

最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察を通じて、選択した体節および神経管のサブドメインにおいて、単一ラベルされた前駆細胞から産生される細胞数の誘導細胞の範囲を示す結果を得ることができます。こんにちは、エルサレム・ヘブライ大学医学神経生物学教室のハイム教授の研究室のRaelです。今日は、ニワトリの体節および神経管への単一細胞注入の手順をご紹介します。

当研究室では、この手順を用いて、ニワトリ胚のsomite（体節）および神経管細胞の系統分離を研究しています。それでは、始めましょう。ニワトリ胚において単一の細胞にトランスフェクションを行うために、まずマイクロピペットを製作します。ピペットの製作には、標準的なNaga PP 83ピペットプラーを使用し、加熱設定を13.5に設定します。

ピペットチップの直径を8〜10 µmにするため、正確な設定で校正を行う必要があります。本手法では、外径1 mm、内径0.75〜0.78 mmのホウケイ酸ガラス管を含むフィラメントを使用しています。また、外径1 mm、内径0.75 mmのフィラメントを備えていない市販のマイクロピペットを使用することも可能です。

準備したピペットは、チップが容器の縁に触れないようにプラスチック製のディッシュに保存します。マイクロインジェクション用のDNAを準備するため、目的のプラスミドをDH5α E. coliにトランスフェクションします。翌日、標準的な手順に従い、Maxi prepキットを用いてプラスミドを精製します。非クローナル注入の場合、DNA濃度は1 µg/µLを使用します。

個別のクローンを得たい実験では、プラスミド濃度を大幅に下げて調整する必要があります。P-C-A-G-G-F-P-Aの場合、0.05 to 0.1 microgram per microliterの濃度が適切です。最適な濃度が決定したら、個別に調製するのではなく、精製したプラスミドストック全体をあらかじめ定めた濃度に希釈することを推奨します。

後者により、おそらく純度や、超らせん構造プラスミドの割合などのその他のパラメータの変動に起因して、成功率にばらつきが生じる可能性があります。マイクロインジェクション用の鶏卵を準備するには、目的の発生段階に達するまで長軸に沿って寝かせた状態で孵化した鶏卵を70% ethanolで拭き、乾燥させます。次に、外科用ハサミで卵の尖った端に穴を開けます。10 milliliterのシリンジと19ゲージの針を用いて、卵から2 milliliterの白蛋白を吸引し、注入前に穴を熱パラフィンで封止します。

外科用鋏を使用して、卵殻の上部に窓を開け、穴の中にゴミが入るのを防ぎます。窓の上にテープを貼り、そのテープに穴を開けます。胚を視覚化しやすくするため、アスピレーターに取り付けた火炎延伸キャピラリーを用いて、剥離した外胚葉の下にpelican 17などの無毒性インクを注入します。

次に、ニードルホルダーに装着した0.14 mmの昆虫ピンを用いて、卵黄嚢膜および羊膜を切開・除去して胚にアクセスし、引いたピペット（Eloqua）にDNAをロードします。そして、キャピラリーを用いて少量のfast green粉末を加えます。適切な直径のプラスミド搭載キャピラリーを、アスピレーターを用いて最小限の量だけ吸引します。その後、キャピラリーをピペットの先端とは反対側の端から挿入し、DNAを先端にできるだけ近い位置までロードします。

次に、マイクロマニピュレーターに取り付けられた手動空気圧インジェクターにピペットを装着します。必要に応じて最小限の圧力をかけ、プラスミド溶液をピペットの先端まで到達させます。ピペット先端の詰まりを防ぐために少量の空気圧をかけながら、ピペットを卵の液体培地内へと操作します。

適切な組織領域を貫通させると、圧力の変化だけで可視化用Fast Greenを含むプラスミドが放出されることが多くあります。放出されない場合は、プラスミドとFast Greenの混合液が排出されるまで、シリンジに軽く圧力をかけます。この手順を胚の軸に沿って繰り返します。注入後にはPBSを添加しても構いません。

最後に、ウィンドウを粘着テープで密閉し、卵をインキュベーターに戻します。換気を避け、湿度を維持して回収率を高めるために、インキュベーター内に少量の水を入れた容器を配置してください。注入の標的部位が、背側体節の神経管や外胚葉内など、容易に確認できる浅い部位であった場合は、蛍光双眼顕微鏡を用いてホールマウント観察を行うことで、実験の成功率を測定できます。

このステップは、ラベル化された細胞が多すぎないか、あるいは少なすぎないかを確認するのに特に有用です。さらにインキュベーションを行う場合は、観察後にPBS含有抗生物質溶液を卵に加え、天井テープを貼り直してください。また、胚を連続切片化して免疫組織化学染色を行うことで、注入の成功率を評価することも可能です。

注射から4時間以上経過後、胚を固定し、パラフィン切片作成のための処理を行います。スライドガラスに貼付した切片を脱パラフィン化し、レポーターを可視化するための免疫染色を行います。この際、ビオチン・ストレプトアビジンなどの増幅法の併用が有効である場合があります。最後に、連続切片をスキャンし、注射した部位におけるラベル化細胞を検出します。

初期の試行において、単一細胞ではなく複数の細胞が得られた場合は、プラスミドストックを希釈し、適切な結果が得られるまで工程を繰り返す必要があります。通常、胚1個あたり6〜12個の節を標的とし、1つのsomiteにつきP-C-A-G-G-F-Pを1回注入します。この設定では、注入から8時間後のホールマウント観察により、10個中1個の胚において、少なくとも1つの節で明確なシグナルを検出することが可能です。

この例では、so節の節肢にGFPをコードするプラスミドを注入し、5時間後に、ここに示す胚のホールマウント像において単一の蛍光細胞が観察されました。中央のso節への注入から24時間後に観察すると、クローン注入の2日後のホールマウント胚において、蛍光細胞のクローンが観察されます。この体節を切片化すると、真皮と筋肉の両方にクローン子孫が存在することが明らかになり、単一の前駆細胞がこれら両方の派生組織を生成することが示されました。

体節と同様に、この横断面（注入から5時間後に撮影）に示されているように、背側神経管内の単一の神経上皮前駆細胞を穿刺することも可能です。連続切片解析の結果、クローン性の導入が達成された際の成功率は約10%であることが明らかになりました。これは、クローン性を確保するためには、定義上、この手法が非常に効率の悪いものであることを意味します。一方で、これらの条件下では、陽性ラベルイベントの93%以上がクローン性であることが判明しました。

本手順におけるニワトリ胚の単一細胞への注入方法について説明しました。大量のストックプラスミドを単一細胞感染に最適な濃度に希釈し、それを一連の実験を通して使用することが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。