細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

電気融合は、近接した細胞に短時間の高電圧電気パルスを印加することによって行われます。本ビデオでは、改良された接着法を用いて、in vitroでの細胞電気融合を実演します。実験はマウスメラノーマ細胞株 BF1を用いて行われました。

実験では、以下の手順に従ってください。2つの別々の培養フラスコで細胞を80%コンフルエンスまで増殖させます。その後、各ストックソリューションを2.1 µLずつ個別に添加します。

10 mMのC-M-F-D-AまたはCMRAを、それぞれ遠心チューブに入れた3 mLのKrebs Hess緩衝液に加えます。細胞をKrebs Hess緩衝液で2回洗浄し、その後、ローディング溶液をフラスコに注入します。ローディング溶液には、それぞれ約7 µMのC-M-F-D-AまたはCMRAが含まれています。

制御された雰囲気下で、細胞を30分間インキュベートします。この最初のインキュベーションの間、領域は細胞膜を自由に通過して細胞質に入り、そこで膜透過性のIMP反応生成物へと変換されます。この最初のインキュベーション後、細胞を洗浄し、その後、培地を用いてさらに2時間インキュベートします。

冷却CCDカメラを備えた蛍光顕微鏡を用い、撮影ソフトウェアで細胞を観察します。励起波長を548 nanometersに設定し、CMRAを導入した細胞の蛍光画像に適切なバンドパスフィルターを選択します。次に、CFDAを導入した細胞については、励起波長を492 nanometersに設定し、緑色蛍光画像用のバンドパスフィルターを選択します。トリプシン処理した両方のフラスコ内の細胞をカウントし、赤色細胞と緑色細胞を1:1の割合で混合し、細胞濃度を5 million cells per milliliterに調整します。

各ウェルの中央に、細胞懸濁液を20 µLずつ滴下します。24ウェルプレートを用い、制御された雰囲気下で細胞を20分間インキュベートし、細胞をウェル表面に単層でわずかに接着させ、細胞同士の接触を形成させます。細胞が入ったマルチウェルプレートを顕微鏡ステージ上に設置します。

電極をウェルの底に配置し、パルスジェネレーターに接続します。最適な電気融合を達成し、細胞生存率を維持するためには、適切な電気パルスパラメータを使用する必要があります。これらのパラメータは細胞株によって異なるため、予備実験で決定してください。培地を除去し、細胞を1 mLのISO potassium phosphate bufferで洗浄した後、細胞の膨潤を誘導するために350 µLのhypos Miller potassium phosphate bufferで洗浄します。

電気パルスを印加する前に、細胞を高浸透圧緩衝液に2分間浸します。電気パルスは、細胞が最大体積に達した直後、すなわち調節性体積減少が始まる前に印加する必要があります。

本実験における減少。1 Hzで持続時間100 µsの矩形パルスを8回連続して印加した。パルス印加後。

10分間経過後、さらに10分間、細胞に刺激を与えず静置します。位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて、拡散効率を判定します。ランダムに選択した5つの視野において、位相差像、赤色蛍光像、および緑色蛍光像の3枚の画像を撮影します。

Image Jソフトウェアを用いて、各画像トリプレットから3つのチャンネル画像を生成し、画像の視覚的品質を向上させます。その後、元の画像に対して、デフォルトのパラメータ設定で背景減算およびコントラスト強調などの前処理を適用します。最後に、Image JのRGB to grayプラグインを使用して、3つのチャンネル画像を合成します。得られた画像では、細胞膜とともに静止期の細胞質を確認することができます。

このように、3チャネル画像を用いて、赤色、緑色、および二重蛍光の3種類の細胞数を容易に決定できます。各画像における全細胞数で二重蛍光細胞数を除し、二重蛍光細胞の割合を算出します。そして、二重蛍光細胞の割合を2倍した値を融合率と定義します。

同じ色の視野の細胞を観察すると、視野内の細胞の半分が検出されないためです。