マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）

本実験の全般的な目的は、培養した哺乳類細胞の細胞質に蛍光標識された低分子化合物またはタンパク質を導入し、それによって誘導される形態変化をマイクロメートルからマルチナノメートル分解能で観察することである。まず、グリッドガラスカバースリップ上で哺乳類細胞を培養し、目的の蛍光標識低分子またはタンパク質をマイクロインジェクションによって注入する。次に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡を用いて観察およびイメージングを行う。

次に、細胞をグルタルアルデヒドで固定し、切片を作成して染色し、電子顕微鏡を用いて撮影します。最後に、明視野蛍光顕微鏡および電子顕微鏡で得られた画像を統合し、アライメントを行います。最終的に、これらの画像を相関させることで、研究者は標的となる低分子化合物またはタンパク質によって誘発された摂動を高解像度で観察することが可能になります。

こんにちは。私はテキサス大学サウスウェスタン医学センター微生物学部門のNeil Alto博士の研究室に所属しているEvan Reddick博士です。本日は、M Clem法、すなわちマイクロインジェクション相関光電子顕微鏡法について解説します。マイクロインジェクションや顕微鏡観察などの単独の手法に対する本手法の主な利点は、グリッド付きガラスカバースリップを使用することで、これらの操作を連携して実施できる点にあります。

この格子状のカバーガラスを使用することで、研究者はプロトコルの異なる段階において同一の細胞に戻ることが可能になります。さらに、この手法により、研究者は多種多様な注入可能な低分子化合物や目的のタンパク質によって誘導される細胞内構造の変化を、マイクロメートルからマルチナノメートルの分解能で観察することができます。マイクロインジェクションの準備として、正常ラット腎細胞や不死化子宮頸がん細胞などの培養細胞を、生細胞用ディッシュに固定されたフォトエッチング加工の格子状ガラスカバースリップ上で、37 °C、5% CO2の条件下でインキュベートします。

使用する実験スケジュールのタイムラインに応じて、細胞のコンフルエンシーを調整します。プレートが完全にコンフルエントになると、電子顕微鏡でマイクロインジェクションした細胞を特定することが非常に困難になります。したがって、短期間の実験を行う日は約50%のコンフルエンシーに、それ以外の場合は約25%のコンフルエンシーに達するように細胞を播種してください。

長時間の実験を行う日に、蛍光標識されたタンパク質、DNA、または低分子化合物を適切なバッファーで調製し、最終容量を50 µLにします。選択した蛍光色素に応じて、Texas redやcascade blueなどのトラッキング色素を添加してください。濃度は0.5～1 mg/mLとなるように添加します。

溶液を0.22 micronの遠心フィルターでろ過します。製造元のガイドラインに従ってマイクロインジェクション用ニードルをプルした後、数µLの溶液をニードルの後端に注意深くピペッティングします。倒立顕微鏡に取り付けられた市販のマイクロインジェクション装置のマイクロマニピュレーターアームにニードルを装着します。

培養細胞が入ったディッシュを倒立顕微鏡のディッシュホルダーに設置します。フォトエッチンググリッド内で増殖している細胞を探し、そのグリッドの英数字識別子を記録してください。これは以降のすべての手順で使用します。

マイクロインジェクションに使用する細胞は、カバーガラスの中央付近に接着しているものを選択し、周辺部のものは避けることが重要です。これにより、後続の電子顕微鏡観察に使用するエポン樹脂センターピースへ、目的の細胞を効率的に転写させることができます。インジェクションアームをカバーガラスの上に手動で下ろし、マイクロマニピュレーターを使用して、針先が細胞表面に軽く触れるまで針を下げます。選択したグリッド内の細胞を1つ飛ばしでマイクロインジェクションします。コンフルエンシー約50%で培養された細胞の場合、600 square micrometerのグリッドあたり約80個の細胞が見込まれ、これにより実験群および対照群合わせて約30から40個の細胞数（N数）が得られます。

注入後、ディッシュをインキュベーターに戻し、目的の時間まで保持してから蛍光顕微鏡観察を行います。培地を除去し、室温でPBS中のホルムアルデヒドを用いて細胞を10分間固定します。固定液をXPBSに置換します。

次に、選択したグリッドの低倍率および高倍率で明視野画像を5〜10枚撮影し、細胞の配置を記録します。マイクロインジェクションされた細胞を特定するために、不活性インジェクション色素の励起および蛍光波長で蛍光画像を撮影します。共焦点顕微鏡を用い、 previously imaged grid（以前に撮影したグリッド）内のマイクロインジェクションされた細胞の高倍率z-stack画像を収集します。

電子顕微鏡を用いて同定する細胞内構造と蛍光画像を相関させるためには、高倍率での観察が必要です。共焦点イメージング後、カバースリップ除去液を使用してディッシュからカバースリップを剥離させ、1×PBSを含む新しい培養ディッシュに細胞面を上にして配置します。その後、電子顕微鏡用の処理に進みます。

標準的な電子顕微鏡（EM）プロトコルに従ってください。サンプルの固定、染色、および脱水を行うため、エポキシ樹脂を調製し、カバーガラスの細胞側を下にしてエポキシ樹脂を満たしたチューブの上に配置します。60 °Cで24時間、樹脂を重合させます。

カバーガラスをエポキシ樹脂から取り除くため、速やかに液体窒素に浸します。これにより、60 °Cから-196 °Cへの温度ショックを与えます。

カバーガラスを樹脂チューブから脱落させます。5〜10分間待機した後、チューブを回収すると、カバーガラスが外れています。解剖顕微鏡下で樹脂の表面を確認し、目的のグリッドを探します。

滅菌済みのカミソリ刃またはメスを用いて、目的のグリッドがブロックの頂点にのみ位置するようにEponブロックをトリミングします。ウルトラミクロトームを用いてトリミング済みブロックの連続切片を作成し、標準的なプロトコルに従って酢酸ウラニルとクエン酸鉛を用いて切片をコントラスト染色します。あらかじめ撮影した高解像度蛍光画像を用いて、細胞の相対的な位置関係をガイドとして、電子顕微鏡内で目的の細胞を特定します。

電子顕微鏡写真の中で、蛍光シグナルに対応する関心領域を特定します。ヘテロクロマチンの位置や核膜などのランドマークを用いて、どの蛍光Zスタック画像がEMのスライスに対応するかを判断してください。Image JやAdobe Photoshopなどの画像処理プログラムを使用して、蛍光画像の不透明度を50%に下げ、対応するTEM画像に重ね合わせます。

表示されているスケールを調整して、画像を位置合わせします。以下は、マイクロインジェクションおよび相関光電子顕微鏡法による結果です。この画像は、レーザーエッチングされたガラスグリッドカバースリップ上で増殖しているNRK細胞の明視野顕微鏡写真を示しています。

注入細胞を含むグリッドを識別するために使用される背景文字のbとmに注目してください。矢印は、電子顕微鏡で識別および撮影された2つの細胞を示しています。ここでは、マイクロインジェクションされた細胞を識別するために使用された不活性トラッキング色素のcascade blueの蛍光画像を示します。

ここでは、アミン標識小分子の明視野信号と蛍光信号を重ね合わせて表示しています。このパネルは、注入された細胞の明視野、蛍光、および電子顕微鏡像の相関を示しています。矢印は、このパネルで高倍率で撮影された蛍光点を示しています。

このビデオを視聴することで、目的のタンパク質をマイクロインジェクションで注入し、マイクロインジェクションCLEM（相関光電子顕微鏡法）を用いて、そのタンパク質が誘発する細胞内形態変化を追跡する方法について十分に理解できるはずです。