で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム

本実験の全体的な目的は、再現可能で定量的な結果を導き出すのに十分な厳密性を備えた、安価なタイムラプス顕微鏡撮影アッセイを開発することです。これは、安価で再利用可能なシリコンガスケットを用いて、アガロース培地プレートまたは顕微鏡スライドを構築することで達成されます。得られた結果から、これらのプレート複合体は、さまざまな培地タイプおよびアガロース濃度において、1週間以上にわたり水分が保持され、十分な酸素供給が維持されることが示されました。

さらに、タイムラプス微小映画撮影は時間がかかるプロセスであるため、8台の安価な顕微鏡を使用することでデータ収集を加速させることができます。こんにちは、シラキュース大学生物学部のRoy Welch博士の研究室のRyan Taylorです。本日は、当研究室で行っている細菌バイオフィルムのタイムラプス動画作成の手順について説明します。この手順を用いて、MTIバイオフィルムの多細胞挙動を研究します。

それでは開始します。この手順を始めるには、まず、一晩培養したOccus sanusの培養液の細胞密度をセルカウンターで測定します。培養液1 mLを2.5 mL遠心チューブに移し、添付の書面プロトコルに従って、細菌をペレット化し、洗浄してTPM培地で再懸濁します。ピペット操作とボルテックスを行い、ペレットを完全に再懸濁させます。これには時間がかかる場合があります。次に、アッセイ用培地である50 mLのTPMに、0.5 gのarosを添加します。

また、0.5 gのarosを50 mLのC-T-T-Y-E（栄養ディスク培地）に加え、オートクレーブで滅菌します。その後、トラッキングアッセイを構築している間、インキュベーターまたはウォーターバスで培地を55 °Cに保持します。

プレート複合体の作製にあたり、まず火炎滅菌したガラス顕微鏡スライドを用いて栄養ディスクを構築します。スライドの上に厚さ 0.5 millimeter の滅菌済みシリコンゴムガスケットを配置します。ガスケットによってスライド上に形成されたウェルに、C TT YE 培地を約 300 microliters ピペットで分注します。

C-T-T-Y-E培地のシャーレに、火炎滅菌した別のスライドガラスを斜めに載せます。スライドガラスを斜めに置くことで、気泡の形成を防ぐことができます。スライドガラスを配置した後、小型のバインダークリップを両側に1つずつ留めて、複合体を固定します。

クリップされた複合体を4 °Cに置き、C-T-T-Y-E培地アガロを凝固させます。通常、これには約5分かかります。アガロが凝固したら、トラッキングアッセイに使用するプレート複合体を調製できます。

まず、アッセイ複合体を構築するためのスライドを準備します。複合体ごとに、2枚のガラス製顕微鏡スライドを火炎滅菌します。スライドの1枚の上にオートクレーブ用ガスケットを置き、アッセイの底部を形成します。

もう一方のスライドは、アガロスの平坦化および支持スライドとして使用します。アッセイの最上層はカバーガラスとなります。まず、顕微鏡スライドをラベルテープで巻き、次にカバーガラスを火炎滅菌し、滅菌した巻きスライドの上に配置します。

カバーガラスを支えるラップされたスライドを上にスライドさせ、カバーガラスが割れないようにします。ピンセットを用いて、火炎滅菌したカバーガラスの上にオートクレーブ用ガスケットを配置します。下のスライドとカバーガラスの両方のガスケットを押し下げ、ガラスとの密閉がなされていることを確認します。

そうしないと、培地アレイが乾燥する可能性があります。スライドガスケットとカバーガラスガスケットのアセンブリを、滅菌面を上に向けた状態で脇に置いてください。ここからは、培地アレイの凝固による動画品質の低下を防ぐため、一度に1つの複合体のみを操作してください。まず、栄養ディスクを配置します。

4°Cから栄養ディスク複合体を取り出します。バインドエクリプスを取り除き、100 µLのガラス製ディスポーザブルチップを装着したマイクロサンプリングピペットを用いて、凝固したC-T-T-Y-Eアガーを露出させてスライドを準備します。同様に、C-T-T-Y-E培地アガーから直径1 mmの栄養ディスクを切り出し、カバーガラス上のガスケットによって形成されたウェル内に配置します。

次に、インキュベーターからTPM培地アガロスを取り出し、カバーガラス上のガスケットによって形成された、栄養ディスクを含むウェルに300 µLをピペットで分注します。TPM培地アガロスを盛り上げて、T-P-M-S-A培地アガロスを平らにします。火炎滅菌したガスケットなしのスライドグラスを、TPM培地アガロスの上の斜めに配置します。スライドグラスを斜めに置くことで、気泡の形成を防ぐことができます。

ミニバインダークリップを両側に1つずつ留め、複合体を固定します。クリップで固定した複合体を4 °Cに置き、培地を凝固させます。通常、これには約5分かかります。

アガロース培地が固まったら、複合体を4°Cから取り出します。バインダークリップを取り外し、複合体の端を絞ります。テープで巻いたスライドを緩めるため、テープで巻いたスライドを取り出し、後で使用するためにベンチの上に置きます。

次に、ピンセットをウェッジ（くさび）として使用し、カバーガラス・ガスケット・メディアアレイ複合体を支持スライドから分離させ、支持スライドを廃棄します。カバーガラス・ガスケット複合体を分離させる際にこじ開けるような動作は行わないでください。カバーガラスの破損や、メディアアレイが支持スライドに固着する原因となる可能性があります。

支持スライドを取り除いた後、カバーガラスガスケット培地アレイ複合体を、ガスケット側を上にしてテープを巻いたスライドの上に配置します。この複合体をバーナーの横に置き、新たに露出した培地アグロスの表面から目に見える水分をすべて蒸発させます。培地アグロスを1分以上乾燥させないでください。

これはM Zantの群れ行動に影響を及ぼす可能性があるため、新たに調製したアッセイ複合体に細胞を播種してください。カバースリップガスケット培地アグロス複合体から余分な水分が蒸発したら、濃縮細胞を0.5 µL吸引し、培地上に滴下します。培地アグロスに近づく前に、ピペットチップを緩やかに押してください。

ピペットチップの先端に細胞の滴が現れるため、チップがメディアアグロスに触れることなく細胞を播種しやすくなります。アグロス表面に凹みができると、スウォームの挙動が変化する可能性があります。ピペットを垂直に下ろし、埋め込まれた栄養ディスクから約1 mm離れた位置に細胞を分注してください。

その後、ピペットをまっすぐ上に引き上げます。これにより、群集（スウォーム）が円形になるようにします。細胞を滴下した後、コンプレックスをバーナーの横に置き、細胞スポットを20秒以内に乾燥させます。

乾燥後、複合体の底部となるスライドガスケットアセンブリをカバーのガスケットに合わせて配置します。複合体の上部となるガスケットメディアアクロセルコンプレックスを滑り込ませます。軽く押し合わせてシールを形成します。

結露を防ぐため、キムワイプでスライドとカバーガラスの表面を拭き、残留物を除去します。スライドを清掃した後、すぐにスライド側を下、カバーガラス側を上にして、加熱ステージの上に複合体を配置します。結露が生じている場合は、画像取得ソフトウェアを起動する前に、複合体を加熱ステージ上に数秒間静置してください。

動画を撮影する準備として、顕微鏡の対物レンズから適切な倍率（2倍、4倍、または10倍）を選択します。カメラと顕微鏡の電源を入れ、光が強すぎないことを確認するために光量を調整します。コンピューターを起動し、画像取得プログラムを開きます。

ライブイメージウィンドウをクリックし、顕微鏡のフォーカスを合わせます。画像はここに表示されているものと同様になります。画像の取得を開始してください。

培地アガロースが沈降して焦点がずれる傾向があるため、最初の1時間は定期的にフォーカスを確認してください。画像取得が完了したら、取得した画像をストレージに転送します。スライド複合体は、90% ethanolに一晩浸して分解させるか、ガスケットをTOLA処理して再利用してください。

このタイムラプス動画は、ここで説明したトラッキングアッセイに供されたemを示しています。撮影速度は20倍の倍率で1分間に1枚であり、再生速度は60fpsです。このタイムラプス動画は、細胞の1%がGFPを発現しているeantの細胞集団を示しています。

この動画は、位相差像と蛍光像を交互に合成して作成されました。アッセイは1% Arosを含むC-T-T-Y-E中で実施されました。撮影レートは、100倍の倍率で1分間に1枚です。このタイムラプス動画は、M Anthesのグライディング運動を示しています。

このアッセイは1% Arosを含むC-T-T-Y-E上で行われました。キャプチャレートは100倍の倍率で1分につき1枚です。このタイムラプス動画はP OSAのtwitching motilityを示しています。このアッセイは1% Arosを含むLB上で行われ、キャプチャレートは1分につき1枚です。

20倍の倍速再生において、再生速度は毎秒60フレームです。このタイムラプス動画は、Smar sensesのスウォーミング運動を示しています。このアッセイはLBおよび1%Arisを用いて実施され、キャプチャ速度は1分間に1枚です。

20倍の倍率で、再生速度は毎秒60フレームです。このタイムラプス動画はEGTのスライディング運動を示しています。このアッセイは、0.5% Agaroseを含むLB培地で実施されました。キャプチャレートは1分間に1枚であり、0.5% Agaroseの脆弱性のため、20倍の倍率での再生速度は毎秒120フレームとなっています。

このアッセイでは、図1 Bに示す大きなガスケットを使用します。ここまで、細菌バイオフィルムのタイムラプス動画の作成方法について説明しました。この手順を行う際は、一貫した結果を得るために、時間をかけ、可能な限り正確に操作することが重要です。

以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。