間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

樹状突起スパインは、シナプス入力を受けるニューロンの樹状突起からの膜突出部です。スパインの伸長、縮小、あるいは出現や消失は、特定の神経活動パターンに起因する神経ネットワーク機能の変化に応じて起こります。この現象は皮質可塑性として知られており、樹状突起スパインの形態学的変化を観察することで確認できます。

生体動物において、マウスの頭蓋骨にイメージングプレートを固定します。頭蓋骨の一部を外科的に薄くし、低倍率および高倍率で画像を撮影します。その後、後日のタイムポイントでこれらの領域を再度撮影します。

得られた結果から、薄層頭蓋骨標本作製を用いることで、複数のタイムポイントにおいて樹状突起スパインの形態を明確に可視化できることが示されました。また、スパインの形態は非常に可塑性が高く、構造の変化だけでなく、樹状突起スパインの出現や消失も認められます。こんにちは、ロチェスター大学神経生物学・解剖学部の Anaya Maka 研究室の Emily Kelly です。

本日は、finsと呼ばれる標本作成後のマウス視覚皮質の慢性的イメージングの手順について解説します。当研究室では、この手法を用いて樹状突起スパインのターンオーバーを研究しています。それでは始めていきましょう。

無菌手術用の器具を滅菌することから手順を開始します。次に、70% ethanolを用いて作業領域を滅菌し、手術面に清潔なドレッシング材を敷きます。フェンタニルカクテルで麻酔をかけたマウスの足指を挟んで反応を確認し、麻酔深度をモニターします。ここで示しているマウスは、GFPが発現しているA-G-F-P-M遺伝子組換えマウスです。

第5層のパラメタ細胞は、浅層へと樹状突起を伸ばしています。体温を37.5 °Cに維持するため、動物を電気毛布の上に置き、直腸温度計で監視してください。次に、眼球の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布し、ハサミを使用して処置します。

マウスの後頭部、耳の後ろから目にかけての被毛を除去します。次に、動物の頭頂部に70%ethanolを塗布して洗浄し、続いてベタダイン・スクラブとベタダイン溶液で洗浄します。耳の後ろから、イメージングを行う半球に応じて正中線の右側または左側に沿って目に向かってLCU切開を行い、皮膚を翻転させて手術部位から遠ざけます。

皮膚は後で微細鉗子を用いて縫合するため、除去しないでください。皮膚をゆっくりと上に引き上げ、目的の領域から遠ざけます。清潔な鉗子を使用して、露出した頭蓋骨領域から骨膜を慎重に掻き出します。

10% fair chlorideを頭蓋骨に少量塗布し、骨膜を完全に乾燥させ、完全に除去されていることを確認します。頭蓋骨が完全に乾燥していることが重要です。接着剤を適切に密着させるため、マイクロサージカルブレードを用いて、乾燥した骨膜を優しく掻き出してください。

次に、ステンレス製ヘッドプレートのイメージングウィンドウの周囲にSanoアクリル接着剤を薄く塗り、プレートを頭蓋骨に固定します。綿棒の木の端を使用して、イメージングウィンドウの内側の継ぎ目に接着剤を塗り、イメージングプレートと頭蓋骨の曲面の間の隙間をすべて埋めてください。その後、ウィンドウの中に接着促進剤を1滴滴下します。

その後、速やかに余分な接着剤を拭き取ります。接着剤が完全に乾燥するまで待ちます。0.7 mmのステンレス製バーを取り付けた歯科用ドリルを使用し、イメージングウィンドウ部分の頭蓋骨を薄く削り始めます。

頭蓋骨への過剰な熱発生を避けるため、時折0.9%滅菌生理食塩水を塗布しながら、断続的にドリリングを行います。頭蓋骨表面に小さなストロークを繰り返し、4 mm × 4 mmのウィンドウを薄く削り出します。

歯科用ドリルを使用します。鈍端鉗子を用いて頭蓋骨の厚さを確認してください。軽く圧力をかけると、頭蓋骨の表面がわずかに陥没します。

撮像に最適な頭蓋骨の厚さは10～30 µmの間です。頭蓋骨を薄くした後、ウィンドウ内のゴミをすべて取り除き、頭蓋骨上に生理食塩水を滴下します。実体顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで、撮像ウィンドウを撮影します。

この写真に写っている脳血管は、その後のイメージングセッションでイメージングプレートを配置する位置を特定するのに役立ちます。動物を2光子顕微鏡装置に移動させてください。動物は加熱ブランケットの上に置いたままとし、イメージングセッションの間、体温を継続的にモニタリングする必要があります。

MiTaiレーザーを搭載した2光子顕微鏡。最大出力を得るために10 Wの固体ポンプが使用され、改造されたOlympus Flow View共焦点ユニットが組み込まれています。本システムは深部組織イメージングに最適化されており、脳からの蛍光検出を最大化するため、外部検出器が対物レンズの可能な限り近くに設置されています。低デジタルズームを使用して、イメージングウィンドウに生理食塩水を一滴滴下します。

顕微鏡に固定したデジタルカメラを使用して、明るくラベル化されたニューロンを含む領域を特定します。次に、撮像領域の写真を撮影します。これは、後のタイムポイントで同じ撮像位置に戻るために必要です。

樹状突起の分岐範囲を確認するため、脳の可視範囲全体にわたる低倍率のスタック画像を取得します。血管と樹状突起は、若年および成体動物においてその構造が維持されるため、これらを後続のタイムポイントにおけるイメージング領域の特定に利用します。イメージングソフトウェアを使用して操作してください。

デジタル倍率を8倍に上げ、必要に応じてXY座標を調整し、樹状突起棘の位置や構造を含む詳細な樹状突起形態を示す高倍率スタックを収集します。パン座標、収集範囲、Zステップサイズ、スタック内のステップ数など、各スタック収集に関する詳細なメモを記録してください。これらのメモは、後日の時点でこの樹状突起または軸索に戻る際に使用します。

イメージング後、ピンセットを用いてヘッドプレートを頭蓋骨表面からゆっくりと剥がして取り除きます。残った接着剤をすべて除去し、0.9%滅菌生理食塩水で頭蓋骨を拭きます。

6番の縫合糸を用いて、頭蓋骨上の皮膚を縫合します。イメージング処置後、当該部位を70% ethanolで拭き取ります。動物が目覚めて自力で動けるようになるまで、ヒートランプの下にある清潔なケージに入れておきます。

その後、動物を元のケージに戻し、2日後から数か月後の任意の時点で再びイメージングを行います。縫合糸を外し、頭部の皮膚を再度開きます。無菌的な手法を用い、初回の手術時に撮影した脳血管系のデジタル画像を使用して、元のイメージング位置を特定します。その後、前述と同様にヘッドプレートを再度固定します。

必要に応じて、マイクロサージェリー用メスを使用して、イメージングの各タイムポイント間に再生した可能性のある骨を慎重に削り取ります。歯科用ドリルで薄く削り、イメージングウィンドウ内の破片を除去して、0.9%滅菌生理食塩水を1滴滴下します。動物を2光子顕微鏡に運び、前回のセッションで撮影したデジタル蛍光画像を用いて、元のイメージング領域を特定します。

フロービュープログラムを起動します。元の低倍率画像を開き、コンピュータ画面に透明シートを貼り付け、透明ペンを用いて主要な血管パターンをスケッチします。次に、ライブ画像を開き、血液血管系を透明フィルム上のスケッチパターンに合わせて再整合させます。

8倍に拡大した構造体を再撮影するために、透明フィルムを取り除きます。前回のイメージングセッションで収集した目的のスタック画像を開きます。コンピュータ画面に貼り付けた透明フィルム上に、構造体のスケッチを描きます。

ライブ画像から8倍にズームし、画像を透過的に合わせます。低倍率での位置合わせの精度に応じて、画像の角度をわずかに調整する必要がある場合があります。ステップサイズや収集画像数など、1日目のイメージングパラメータにパン座標を設定し、Zスタック再イメージングを最大2回まで実施します。頭蓋骨の完全性を損なうと、GFP発現マウスにおいてイメージング解像度が低下するため、頭皮を開く回数は制限する必要があります。

in vivo 二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、第5層のパラメタ細胞の一部および対応する樹状突起を可視化しました。ここではGFPで標識された視覚野の樹状突起が示されています。この画像は、PIAから最終深度 175 µm まで 5 µm ごとに得られた単一画像の投影図です。枠で囲まれた領域を、0日目に高倍率で示し、続いて 4日目に再び高倍率で示しています。0日目と 4日目の樹状突起分枝画像の高倍率比較図です。

これらの画像では、白い矢印で安定したスパインを、赤い矢印で消失・退行したスパインを、そして緑の矢印で新生スパインを示しています。以上で、薄い頭蓋骨標本を用いたマウス視覚皮質における慢性的な2光子イメージングの手法を説明しました。この手順を行う際は、頭蓋骨およびその下の硬膜を損傷するとイメージングの解像度が低下するため、薄層化の過程で細心の注意を払うこと、および詳細な記録を取ることが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。