慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

脳機能の研究において、イメージング技術の重要性はますます高まっています。その中でも、適切な準備を整えることで生きた脳の研究が可能となる2光子レーザー顕微鏡法は、極めて有用な手法として台頭してきました。この技術を用いることで、同一の皮質領域を数分から数ヶ月にわたって慢性的に観察することが可能になります。

このビデオでは、2光子顕微鏡を用いた脳の慢性的なin vivoイメージングのための準備について説明します。本日実演する頭蓋窓の作製法は、ジャネリア・ファームのハワード・ヒューズ医学研究所の研究員であるCarl Voda博士によって最初に開発されました。そして、カリフォルニア大学ロサンゼルス校神経学部のCarlos Porter Cayo研究室からRicardo Mustが担当します。

本日は、慢性的なin vivoイメージングのための頭蓋窓作成の手順について解説します。この手法は、2光子レーザー顕微鏡を用いて脳深部をイメージングできるため、非常に有用です。それでは、始めていきましょう。

手術を開始する前に、マウスをイソフルランで麻酔します。導入には4%、手術中は1.5〜2%を使用し、I-A-C-U-C承認のプロトコルに従います。動物が完全に鎮静されているか確認するため、尾または足先を挟んで反応を見る（ピンチテスト）ことが重要です。げっ歯類用バリカンを用いて、首の後ろから目までを脱毛します。

除毛後、マウスをステレオタキシックフレーム上に固定し、37 °Cに設定した温水循環ブランケットの上に置きます。耳バーを用いて頭部をしっかりと固定します。次に、動物の眼球の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布します。続いて、デキサメタゾン 0.2 mg/kg およびカルプロフェン 5 mg/kg を皮下投与します。

脳の浮腫および炎症反応をそれぞれ防止するためです。手術を開始する前に、70%アルコールとベタジンを交互に3回拭き取り、手術部位を必ず滅菌させてください。すべての手術器具はガラスビーズ滅菌器であらかじめ滅菌されており、ハサミにはエタノールをスプレーして使用しています。

頭蓋頂部の皮膚を除去します。まず頭部の基底に沿って水平に切開し、続いて吻側方向へ眼瞼に達するまで2本の切開を入れます。次に、正中線で合流するように2本の斜切開を加えます。この時点で、過度な出血や痛みを防ぐため、骨膜にリドカインおよびエピネフリン溶液を1滴滴下し、メスを用いて骨膜を頭蓋骨の端まで剥離させます。

後頸部の筋肉も軽く牽引します。次に、露出した頭蓋骨の全領域をメスで穏やかに掻き、表面を乾燥させます。これは、後で接着剤を塗布する際に、より強力に密着させるために非常に重要です。

イメージング部位を決定したら、まず頭蓋窓を作成します。ニューマティック歯科ドリルを用いて、直径約4 mmの円を慎重に描きます。軽く穿孔した後、リドカイン・エピネフリン溶液を再び頭蓋骨表面に塗布します。

骨の非常に薄い層（通常は1枚分）が残った時点でドリリングを停止します。この段階は、生理食塩水を1滴滴下し、開頭部の中心を軽く押して骨が沈み込む感覚を確認すること、および骨梁という骨の海綿状構造を利用することで判断します。

非常に細いチップの鉗子を用いて、開頭部位を頭蓋骨から持ち上げます。生理食塩水の使用は、頭蓋骨を持ち上げやすくし、硬膜の出血を防ぐため重要です。次に、あらかじめ生理食塩水に浸しておいたゲルフォームを硬膜に適用し、頭蓋骨の除去時に時折発生する微小な出血を止血します。

硬膜表面を乾燥させ、出血がないことを確認した後、滅菌済みの5 mmガラスカバースリップを硬膜の上にそっと置きます。シアノアクリレート系の接着剤を頭蓋骨の反対側の半球に1滴滴下します。針を用いて、ガラスの下に入らないよう注意しながら、ウィンドウの周囲全体に接着剤を丁寧に塗布します。

ここで、頭蓋骨の表面全体に接着剤を薄く塗布します。接着剤が乾燥した後、デンタルアクリルを混合し、カバースリップを固定するためにその縁のわずかな部分も含め、頭蓋骨表面全体に塗布します。カバースリップを固定した後、デンタルアクリルを用いてウィンドウの周囲に小さなウェルを作成します。

また、歯科用アクリル樹脂にチタンバーを埋め込みます。このバーは、後にマウスを顕微鏡のステージにしっかりと固定するために使用します。イメージングにおいて、バーが頭蓋窓と平行になるよう、水平に設置することは非常に重要です。

バーの下に紙を置くことで、アクリルが硬化するまでバーを水平に保つことができます。歯科用アクリルを10分間キュアまたは硬化させ、その間にチタンバーが固定されます。その後、動物を暖かいケージに入れ、回復を待ちます。麻酔から回復後、同日に動物のイメージングを行うことができます。

この動画では、生後3か月のGFPMマウスの体性感覚皮質上に設置した頭蓋窓を通して、自作の二光子顕微鏡を用いて5 µm間隔で撮影した160枚の画像スタックを示しています。このトランスジェニックマウス系統は、錐体ニューロンの小さなサブセットにGFPを発現しています。第5層および第2/3層の画像は、励起波長910 nm、開口数0.8の40倍水浸対物レンズを使用して撮影されました。

より浅層の画像では、パラメタル細胞の頂帯樹状突起の樹状分枝を容易に認識できます。各ニューロンの樹状突起の頂端部（アピカルタフト）は、単一の大きな頂帯樹状突起に収束しています。この主頂帯樹状突起から分岐するより小さな斜樹状突起も見られ、視野を横切る軸索も認められます。

これは、同じ40倍の対物レンズを用いて1.5 µm間隔で撮影した12枚の画像のスタックであり、高倍率により、個々の樹状突起棘（スパイン）を識別できる十分な高解像度で表層の樹状突起が示されています。ここでは、2光子顕微鏡を用いた脳の慢性的イメージングのための頭蓋窓作製法について解説しました。この手法は、生きた脳の構造と機能の両方を、単一のイメージングだけでなく、数ヶ月にわたる複数回のイメージングを通じて慢性的に研究できるため、脳研究において極めて強力な手法となります。

頭蓋窓作製のもう一つの利点は、広い視野をイメージングできることであり、これにより軸索全体や樹状突起などの大きな構造を数ミリメートルの範囲にわたってイメージングすることが可能になります。この処置を行う際は、可能な限り清潔で無菌的な条件下で作業すること、および非常に安定した手つきで操作することが重要であるという点に留意してください。以上で完了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。