偽骨折：急性末梢組織外傷モデル

大腿骨や脛骨などの長管骨が骨折すると、損傷した筋肉や軟部組織が、破損した骨片や骨髄にさらされます。これに続いて、組織修復を促進するための強力な免疫反応が起こります。この露出による影響を研究するためのモデルは、両側の大腿骨と脛骨を採取することで構築できます。

ドナーマウスから採取します。骨を砕いて骨溶液を作成し、それをレシピエントマウスの負傷した大腿部に注入します。その後、免疫反応をモニタリングし、遠隔臓器の損傷を評価することで、骨折誘発外傷の長期的影響を研究します。

両側大腿骨骨折モデルなどの既存の末梢組織外傷法に対する本手法の主な利点は、この擬似骨折モデルでは、長期の麻酔や複雑な骨折固定技術に伴う合併症がなく長期生存が可能であるため、外傷後の後期における免疫応答の研究が可能になる点である。手順を開始する前に、氷入りバケツ、ベタジン、手術器具、GRE止血鉗子、乳鉢と乳棒、ピンセット、20ゲージ針、1 CC シリンジ、PBS、麻酔薬、およびイソフルラン用ノーズコーンを用意する。年齢と体重を合わせた安楽死済みの個体を1匹用意する。

遺伝子ドナーマウス1匹から、3匹のレシピエントに十分な材料を採取できるはずです。ドナーをプレキシガラス板に固定し、後肢は足先のみをテープで固定するようにしてください。その後、後肢を慎重に除毛します。

その後、滅菌のためにベタジンとアルコールで全体を十分に覆い、下肢から長骨を取り出します。鼠径部の皮膚に外科的切開を加え、そこから足首に向かって肢の長さに沿って皮膚を切開し続けます。内側および外側の両面で、皮膚を牽引して皮下筋膜および筋肉から剥離します。次に、脛骨の前外側に位置する筋肉の下に、ハサミの片方の刃を挿入します。刃を近位および遠位にスライドさせ、下層の骨から筋肉をきれいに持ち上げて剥離します。

この手法を脛骨の後面および内側下面にも繰り返し、脛骨の下にある筋肉を分離します。これらの脚筋の近位端で腓骨を脛骨から外すために遠位方向にスライドさせる際は、後面への過剰な負荷を避けてください。腱を付着部のできるだけ近くで切断し、筋肉群をまとめて下方に引っぱりながら遠位方向に牽引します。軽く引っぱることで足関節からの遠位付着部が外れます。その後、ハサミを用いて足関節を切断してください。

この時点で脛骨を大腿骨から切り離さないでください。この接続があることで、大腿骨を股関節から剥離させる際に役立つ追加のレバレッジが得られます。大腿骨から筋肉を剥離させる際にも同様の手法を用います。必要に応じて、後方、および内側と外側の両方でこの操作を行ってください。

これらの筋群の遠位停止部を切断し、膝関節から離します。十分な術野を確保するために、必要に応じて皮膚切開を延長し、筋肉の下を辿ります。大腿骨端を股関節から剥離させるため、ドナーマウスから大腿骨とそれに付随する脛骨を取り出し、滅菌ガーゼの上に置きます。

それぞれの骨を別々の手で握り、それぞれの長軸に沿って互いに逆方向にゆっくりとねじるか回転させることで、膝関節で2本の骨を分離します。長骨に残っている腱の付着部を除去するために、4×4インチのガーゼを骨の長さに沿って巻き付けます。それをしっかりと握り、骨の全長にわたって数回スクレイピングし、表面から残りの組織を取り除きます。

回収した骨を、氷上の滅菌済み1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに入れます。ドナー骨を、十分に消毒した生物安全キャビネットまで搬送します。骨溶液を調製します。

クリーンベンチ内に、滅菌済みのフィールドドレッシング、滅菌済みの乳鉢と乳棒、滅菌済みのピンセット、滅菌済みの 8 mL チューブ、滅菌済みの PBSA、1 mL ピペットおよび対応するピペットチップを用意します。また、100 µL ピペットマンおよび対応するチップ、1 mL シリンジ、20G 針を用意します。ピンセットを用いて骨を乳鉢に移し、乳棒で骨を穏やかに砕きます。乳鉢に 1 mL の PBS をピペッティングし、円を描くように砕き続けることで、完全に懸濁させます。

次にPBSをさらに1 mL加え、粉砕を続けて骨溶液を作成します。溶液はピンク色になります。大きな残渣が残るように注意しながら、乳鉢から8 mLチューブに溶液をゆっくりと注ぎます。その後、骨溶液を1 mLシリンジに移します。

20ゲージの針を用い、骨溶液は氷上に保持してください。骨溶液 1 µL を Mac congar プレートにピペッティングし、表面全体に均一に広げます。無菌性を確認するため、プレートを 24 ～ 48 時間インキュベートしてください。

足指をつまむことで、ペントバルビタールで麻酔をかけたマウスの麻酔深度を確認し、軟部組織損傷および骨溶液注入の手術 procedure を開始します。マウスをプレキシガラス板の上に仰臥位で配置し、オスカー社製クリッパー（40番ブレード）を用いて腹部、鼠径部、および大腿部を剃毛します。その後、各肢の遠位端に粘着面を外側にした薄いテープを緩く巻き付け、動物を固定します。

マウスを滅菌済みの手術野に移動させます。手術部位をベタジンで拭き取り、その後、アルコールで拭いて滅菌します。

99% isof fluorineを1 mL含浸させたガーゼを配置したノーズコーンをマウスに装着します。動物の呼吸が緩やかになり始めたら、ノーズコーンを取り除きます。処置のどの段階においても、さらに麻酔が必要な場合は、ペントバルビタールを追加注入するか、isof fluorineを投与してください。

次に、滅菌フィールドドレッシングを折りたたみ、マウスに被せます。このとき、下肢と頭部のみが露出するようにしてください。本ソフトティッシュ損傷モデルは、両後肢の圧挫損傷です。マウスの後肢がわずかに外転し、外旋した状態で配置されていることを確認してください。

これにより、適切な筋肉へのアクセスが容易になります。圧壊損傷を再現するために膝屈筋群をまとめます。大腿骨に沿った大腿後部筋肉群の中点に、凸面を大腿骨側に向けて18 centimeterの大型止血鉗子をクランプします。止血鉗子を1回目のクリックのみでロックし、30 seconds間保持します。

針先（ベベルの先端）が大腿骨にちょうど触れるまで、皮膚を2〜3 mm 貫通させて挿入します。破砕した大腿筋組織に、骨溶液 0.15 mL を左右それぞれ注入します。針を抜き、直ちに滅菌手袋を着用した指を注入部位に当て、傷口からの骨溶液の逆流を防ぎます。

この指を数秒間そのまま保持します。マウスをケージに戻し、麻酔が切れるにつれてすぐに自由に動けるようにします。適切に、マウスの覚醒に合わせて疼痛管理を行う必要があります。

この概略図は、0時間時点での外傷後の二相性免疫応答を示しています。まず外傷が誘発されます。続いて、6時間でピークに達する初期の過剰炎症反応が起こり、これは全身性炎症および遠隔臓器不全の評価を通じて測定されます。

外傷後の免疫応答の第2の構成要素は、免疫細胞の機能不全によって測定される遅延性免疫抑制であり、48時間付近の谷として描かれています。これは、外傷直後に血漿中で起こる炎症性サイトカイン反応の代表的な図であり、全身性炎症の一例です。肝損傷によって測定される遠隔臓器不全も、同様の時間枠内で上昇することが分かっています。

この代表的な図は、外傷後の後期における免疫細胞の機能不全を強調するための例です。この手順を実施する際は、実験全体を通じて無菌状態を維持し、精密な操作を行うことが重要です。これは、実際の骨折や創傷感染のモデルではありません。